肠毒素大肠杆菌定居因子CS3和肠毒素融合抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的共表达(英文)

不耐热肠毒素 (LT)和耐热肠毒素 (ST)是产肠毒素大肠杆菌的主要致病因素 ,CS3为该菌的优势定居因子 ,是定居因子CFA/II菌毛抗原的共有抗原组分。采用基因操作技术将编码CS3和融合肠毒素蛋白基因转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗候选株X4 0 72中进行表达。用重组菌株口服免疫小鼠后 ,免疫动物能产生抗CS3、LT和ST的血清抗体。特别有意义的是 ,所产生的抗ST抗体能中和天然ST的生物活性。

鸽源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及耐药与毒力基因检测

旨在鉴定广西某鸽场分两批送检的疑似鸽副伤寒病例的病原并对病原菌的耐药性和毒力基因进行检测分析;对从病鸽肝脏组织分离的病原菌进行培养特性观察、生化鉴定、血清型鉴定及16S rRNA测序分析,并通过药敏试验、耐药基因和毒力基因检测对分离菌株进行耐药性和毒力分析。分离到2株革兰氏阴性短杆菌,结合生化鉴定、血清型鉴定和16S rRNA分析结果,表明2株分离菌株均为鼠伤寒沙门氏菌。药敏试验结果表明,2株鼠伤寒沙门氏菌均对萘啶酸、链霉素和四环素耐药,并呈现多重耐药表型,耐药基因检测结果与耐药表型相符。2株鼠伤寒沙门氏菌中invA等12种毒力基因检测呈阳性。结果表明,成功分离鉴定2株具有多重耐药性并携带大量毒力基因的鸽源鼠伤寒沙门氏菌,可为鸽源鼠伤寒沙门氏菌的防治和研究提供参考。

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中 ,重组菌经LB固体及液体培养基连续传 15代后 ,单个菌落和菌液均呈绿色 ;在体内稳定试验中 ,经ICR小鼠连续传代 10次 ,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色 ,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS_PAGE结果显示 ,鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为 2 7kD ,这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/C小鼠后 ,观察 1个月未见有异常现象 ,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型 ,为研究沙门氏菌疫苗和沙门氏菌疾病的致病机理提供了一个有力的工具 。

表达PRRSV GP3蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建

构建表达猪PRRSV GP3蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。将去信号肽序列的PRRSV ORF3基因插入到表达载体pYA3341(Asd+)中,构建重组质粒pYA3341-ORF3。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(Asd-、Cya-、Crp-),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF3)。体外鉴定重组菌表达的GP3蛋白、重组菌特性并进行小鼠免疫试验。酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳及Western blot检测有GP3特异性蛋白条带,小鼠免疫后可检测到GP3蛋白抗体。成功构建能稳定表达PRRSV GP3蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建及动物免疫试验

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。PCR克隆除去信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-ORF5。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失Asd、Cya、Crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5)。鉴定重组菌GP5蛋白的表达;测定重组菌定居特性及安全性;检测免疫小鼠血清抗体;流式细胞仪检测重组菌对小鼠T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群的影响;最后进行免疫猪血清抗体检测。结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;Western blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;重组菌在体内可较稳定地定居于小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏中,并在其中表达出GP5蛋白;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;重组菌口服免疫小鼠可以产生抗GP5蛋白抗体且抗体具有中和活性;重组菌株能不同程度地使CD4+、CD4+/CD8+升高,而使CD8+下降,表明重组菌对细胞免疫功能具有调节作用;淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱发小鼠产生较强的细胞免疫应答;重组菌口服免疫猪可以产生抗GP5蛋白抗体。本试验成功构建了能稳定表达PRRSV GP5蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定基础。

表达禽流感病毒特异性siRNA分子减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

为了寻找一种新的短干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）片段的表达和递送系统，并进行评价，根据禽流感病毒核苷酸序列，设计了3条分别针对A型禽流感病毒核衣壳蛋白、聚合酶A和H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性siRNA分子，人工合成相应DNA片段，退火后形成双链，与阴性对照片段分别连接到构建的pSIREN—ASD ZsGreen载体鼠源U6启动子下游，测序鉴定证实获得了阳性质粒，分别命名为PAZ—NP、PAZ-PA、PAZ—HA和PAZ-NC，1ng的质粒可以完全抑制50个PFU的禽流感病毒在MDCK细胞上的复制，细胞不产生任何病变，细胞上清的血凝效价为2^0，而对照组细胞在病毒感染36～48h后细胞变圆、死亡、脱落，其细胞上清的血凝效价可达2^4。将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到重组沙门氏菌X4550（PAZ—NP）、X4550（PAZ-PA）、X4550（PAZ—HA）和X4550（PAZ-NC）。对4日龄雏鸡口服1×10^9菌落形成单位（CFU）的重组菌后第1d、7d、15d用10。ELDso的H5亚型AIV进行攻毒，最后一次攻毒后观察15d，实验结束时采泄殖腔棉拭子对存活鸡进行病毒分离。结果表明，表达不同的siRNA分子对雏鸡有一定的保护力，保护率为27％～50％不等，存活鸡泄殖腔棉拭子未分离到病毒，说明重组减毒沙门氏菌携带质粒在体内产生的siRNA能够对机体产生一定保护力。

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌感染动力学

用表达绿色荧光蛋白 ( green fluorescentprotein,GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 X4 5 5 0 ( p YAGFP)给 BAL B/c小鼠尾静脉注射和口服 ,对小鼠脏器进行细菌计数 ,并用间接 EL ISA法测定血清中抗细菌的抗体。结果表明 ,静脉注射重组菌的小鼠在肝脏、脾脏中重组菌数量有 2个峰值 ,总的趋势是越来越少 ,而血清中抗体效价越来越高 ,可以初步推断 ,肝脏、脾脏中的细菌数量与血清中的抗体水平呈一定的相关性 ;口服重组菌的小鼠 ,在各脏器中重组菌的数量呈现正态分布的变化趋势 ,其中派伊尔结 ( Peyer′s patches,PPs)中细菌数量与血清中的抗体水平呈一定的相关性 ,而脾脏、肝脏及肠系膜淋巴结中细菌数量与血清中的抗体滴度无关。

表达绿色荧光蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcoRⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下 ,克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRⅠ和NcoⅠ位点之间 ,构建成重组表达质粒pYAGFP ,然后转化大肠杆菌X6 2 12、中间宿主X3730、终末宿主X45 5 0。X45 5 0于LB培养基上呈绿色 ,在荧光显微镜下观察 ,整个菌体发绿色荧光。构建的表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌为减毒沙门氏菌活载体基因工程疫苗的研制提供一个良好模型。

表达GFP的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌体内感染抗原呈递细胞的动态变化

目的 :阐明重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内早期感染抗原呈递细胞 (APC)的动态变化规律。方法 :用一定剂量的表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4 5 5 0(pYAGFP)口服接种BALB/c小鼠。 3d后 ,取腹腔巨噬细胞培养 2 4h ,用荧光显微镜观察。另以该细菌静脉注射小鼠 ,于感染后 3、6和 12h,制备脾脏、肝脏低浮密度细胞。用流式细胞术检测巨噬细胞和树突状细胞的感染率。结果 :巨噬细胞感染X4 5 5 0 (pYAGFP)的百分率 ,腹腔中约为 5 0 % ,肝脏和脾脏中约为 2 0 %～ 4 0 %。树突状细胞感染X4 5 5 0 (pYAGFP)的百分率 ,脾脏中约为 4 %～ 10 % ,肝脏中约为 10 %～ 2 0 %。巨噬细胞的吞噬能力明显高于树突状细胞。结论 :感染早期 ,重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内已被APC所摄取 ,为诱导有效的免疫应答提供了先决条件。

携带EGFPC3质粒的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的表达

目的构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X8786/pEGFP-C3,检测增强型绿色荧光蛋白C3(EGFP-C3)在小鼠体内荧光表达。方法将质粒pEGFP-C3电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌X8786(pEGFP-C3),分别灌胃饲服昆明种小鼠,流式细胞仪检测脾脏细胞荧光表达,利用荧光显微镜检测小鼠组织荧光表达。结果在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后,单个菌落和菌液均呈绿色;流式细胞仪结果证实,体外情况下,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入小鼠腹腔灌洗巨噬细胞,并在其中表达。在体内稳定试验中,经昆明种小鼠连续传代10次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。用免疫剂量的重组细菌接种昆明种小鼠后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。免疫一定时间后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达。结论表达EGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌的成功构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型。

融合表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和卵清白蛋白CD8^+T细胞表位的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

依据淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)主要保护性抗原CD8+T细胞表位VRRPQASGVYMGNLTAQ和卵清白蛋白(OVA)CD8+T细胞表位SIINFEKL,设计、合成两条编码LCMV和OVACD8+T细胞表位的寡核苷酸片段,经退火后,克隆入绿色荧光蛋白表达质粒pYAGFP,经PCR扩增和序列测定分析,证实成功构建T细胞表位与绿色荧光蛋白融合表达的重组质粒pYAGFPL＿O,将此重组质粒pYAGFPL＿O转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,获得重组沙门氏菌X4550(pYAGF PL＿O)。用SDS＿PAGE电泳测得重组菌表达的融合蛋白约为30kD。同时,荧光显微镜下观察到X4550(pYAGFPL＿O)发出黄绿色荧光。这些结果表明LCMV和OVAT细胞表位已成功表达。重组菌X4550(pYAGFPL＿O)的获得为研究沙门氏菌载体携带外源抗原的T细胞应答规律及调控机理打下了重要基础。

携带pEGFPC3的减毒鼠伤寒沙门氏菌在雏鸡体内的表达

构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/pEGFP-C3,检测了PEGFP-C3在雏鸡体内荧光表达。将重组减毒鼠伤寒沙门菌SL8786/pEGFP-C3分别灌胃饲服3日龄雏鸡,结果表明,在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传20代后,单个菌落和菌液均呈淡绿色。流式细胞仪结果证实,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入脾脏细胞,并在其中表达。在体内稳定试验中,经雏鸡连续传代12次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。用免疫剂量的重组细菌接种雏鸡后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。免疫一定时间后,在雏鸡肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达。表达PEGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌在鸡体产生荧光表达,为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型。

针对鼠伤寒沙门氏菌致病性岛Ⅲ筛选中药活性成分作为鼠伤寒沙门氏菌潜在毒力抑制剂

目的:筛选中药活性成分作为鼠伤寒沙门氏菌致病性岛III(Salmonella pathogenicity island III,SPI-3)潜在毒力抑制剂。方法:通过分子对接技术明确中药成分与SPI-3中的MgtC蛋白的潜在结合关系。使用β-半乳糖苷酶测定法评估中药成分对mgtC转录的影响。最后,通过评估细菌生长曲线和关键代谢基因的转录水平研究药物对细菌生长的影响。结果:所有27个候选中药成分均显示出与MgtC结合的潜力。阿魏酸、对羟基肉桂酸、牛蒡子苷和掌叶防己碱使mgtC的转录活性降低了15%以上。这四个成分对mgtC转录的最低抑制浓度分别为:阿魏酸16μM;对羟基肉桂酸40μM;牛蒡子苷80μM;掌叶防己碱160μM。此外,我们证实这四种成分均未抑制细菌生长。结论:在本研究中,我们建立了一种基于β-半乳糖苷酶测定法的鼠伤寒沙门氏菌毒力抑制剂筛选方法。以SPI-3为靶标,筛选了27种中药成分,发现有4种对鼠伤寒沙门氏菌毒力具有潜在的强效抑制作用。这为未来从草药中开发新型抗生素提供了先导化合物。这种方法也可用于筛选其他致病菌的毒力抑制剂。

减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统介导Apoptin对肿瘤细胞糖酵解的影响

为进一步探讨重组减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统介导Apoptin对肿瘤细胞糖酵解的影响,将重组减毒鼠伤寒沙门菌∆crp∆asdSL1344(pYA3493-SopE-Apoptin)和互补菌株∆crp∆asdSL1344(pYA3493-SopE)分别于体外感染黑色素瘤B16F10细胞,于感染后12 h和24 h收集细胞,检测细胞内丙酮酸、乳酸含量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的活性。结果显示,重组菌感染组能极显著下调丙酮酸含量(P<0.01);在感染24 h后,重组菌组乳酸含量极显著低于互补菌组和细胞对照组(P<0.01)。丙酮酸激酶和己糖激酶活性检测结果显示,重组菌组丙酮酸激酶活性和己糖激酶活性均显著低于互补菌组和细胞对照组(P<0.05)。以上结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统介导Apoptin能抑制肿瘤细胞糖酵解的能力,通过下调丙酮酸和乳酸含量,降低丙酮酸激酶和己糖激酶活性,导致肿瘤细胞发生明显的代谢变化。

鸡体内减毒鼠伤寒沙门氏菌的繁殖和免疫反应

初步研究了cya和crp双基因突变减毒鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonellatyphimurium )在鸡体内的繁殖和免疫反应。 1、4或 7日龄肉鸡分别经口感染 10 8或 10 9CFU减毒S .typhimuriumX4 5 5 0 ,接种后 3～ 4周鸡体内特异性细胞和体液免疫达到最高峰。 4日龄口服 10 9CFU组免疫效果最佳 ,但 1日龄高剂量组表现增重降低及免疫抑制。 2 8日龄每鸡口服攻击 10 10 CFU强毒S .typhimurium 5 0 333,各免疫组保护率为 10 0 %。同时免疫鸡还能全部或部分阻止沙门氏菌在肝脏和脾脏的繁殖。接种后减毒S .typhimurium在泄殖腔的检出时间为 4周左右。

减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的鸡传染性支气管炎病毒s1基因DNA疫苗及其免疫效力研究

为研制鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗,构建和表达了运送鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。首先将鸡传染性支气管炎病毒M41株的全长s1基因插入到嵌合CpG DNA的真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1-CpG。然后将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建出运送DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)。将重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)分别以1×109CFU,5×109CFU,1×1010CFU的剂量滴鼻和口服接种4日龄雏鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果表明重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)具有良好的安全性。在免疫后35 d,商品鸡体重测定结果表明重组菌免疫不影响鸡体增重。以5×109CFU重组菌滴鼻和口服两次接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,二免3周后,血清抗体和小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组抗体水平与空白对照组、空载体对照组之间分别存在极显著性差异(P<0.01)。攻毒试验结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组有较高的免疫保护效力,与灭活苗和减毒苗效力相当,显示出一定的应用前景。

携带TIP30与人IFN-γ基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建及抗腺样囊性癌的初步研究

目的:构建含有TIP30与人IFN-γ基因的真核共表达质粒的减毒伤寒沙门氏菌,观察以减毒伤寒沙门氏菌为载体的,联合TIP30与IFN-γ的基因治疗对腺样囊性癌的疗效。方法:PCR扩增TIP30和人IFN-γ基因,分别插入真核表达载体pCI—neo,构建成重组表达质粒pCI-TIP30、pCI-IFN和TIP30、IFN-γ基因共表达质粒pCI-TIP30/IFN。分别将重组表达质粒转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,体外感染小鼠巨噬细胞株,用免疫印迹和ELISA对表达产物进行鉴定,将重组菌口服给腺样囊性癌荷瘤裸鼠,观察其疗效。结果:免疫印迹试验表明质粒pCI-TIP30和pCI-TIP30/IFN转化菌感染的小鼠巨噬细胞能表达TIP30蛋白,ELISA检测则显示pCI-IFN和pCI-TIP30/IFN转化菌感染的小鼠巨噬细胞能分泌性表达人IFN-γ,减毒沙门氏菌本身和3种表达质粒转化的重组沙门氏菌对腺样囊性癌均有治疗作用,且TIP30与IFN-γ具有明显的协同作用。结论:成功构建了分别携有真核表达质粒pCI-TIP30、pCI—IFN、pCI-TIP30/IFN的减毒鼠伤寒沙门氏菌,对腺样囊性癌荷瘤裸鼠有显著的治疗作用。

以减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的安全性与免疫效力

将运送 H5亚型高致病力禽流感病毒 DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 X4 5 5 0 (p VAX1- HA)和 X4 5 5 0 (asd-p VAX1- HA )以 1× 10 1 0 CFU的剂量腹腔注射 1日龄 SPF白莱航雏鸡 ,结果表明 ,二者均具有良好的安全性。对 SPF白莱航鸡的免疫原性试验结果表明 ,这 2种细菌均能刺激鸡体产生高水平的肠道粘膜免疫应答 ,但是不能有效地激发血清抗体应答。对商品代伊莎褐蛋鸡的免疫效力试验初步结果显示 ,X4 5 5 0 (asd- p VAX1- HA)免疫鸡能够抵抗强毒的攻击 ,保护指数为 77.8% ,而 X4 5 5 0 (p VAX1- HA)

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定

试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组HBsAg口服疫苗构建与鉴定

采用大量培养含有pcDNA3s的大肠杆菌,提取pcDNA3s质粒,利用电转化方法将pcD-NA3s质粒转化到感受态减毒鼠伤寒沙门氏菌,SDS-PAPG检测到930 bp大小的条带,基因序列分析到重组菌含有乙肝表面抗原(HBsAg)基因序列;观察重组菌体外传代培养的稳定性,该重组菌株在体外能稳定地繁殖、生长和传代。试验结果表明,携带HBsAg的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗X8786/pcDNA3s已成功构建,为研究和应用人和动物治疗用乙型肝炎病毒口服基因工程活疫苗奠定了基础。