抑制性减法杂交技术及其应用

本文介绍了抑制性减法杂交技术的原理和方法 。

一种改进的构建杂交扣留cDNA文库的方法

介绍了一种改进的利用减法杂交构建λ噬菌体ｃＤＮＡ文库的方法，该方法利用处理的ｓｃＤＮＡ减去两种对照的ｍＲＮＡ富集目的ｓｓｃＤＮＡ并用磁珠法分离杂交单体，结果表明其增加了杂交单体的产量、简化了实验步骤，而且更有利于富集所需基因，是构建ｃＤＮＡ文库的一个有效改进．

利用减法AFLP有效标记小麦中的外源染色体片段(英文)

为解决AFLP中样品间共同片段对多态性片段识别的干扰 ,作者建立了一种“减法AFLP”标记技术 ,并运用这种技术成功对小麦中的外源染色体片段进行了标记。运用该技术 ,样品间的共同扩增片段显著减少 ,在非变性聚丙稀酰胺凝胶上带型差异十分明显 ,多态性片段很容易分辨。其真实性通过将其中两条成功转换成外源染色体片段特异的SCAR标记得到了验证。减法AFLP标记技术的建立为标记作物中的外源染色体片段提供了一种有效手段。

冬小麦春化作用相关cDNA克隆Vrc79的分子克隆

在低温需求型植物的发育过程中，春化作用是诱导植物成花的必要因子。在冬小麦春化进程中存在着一个核酸代谢的关键期，为了探讨春化作用的分子机理，以不春化及脱春化的冬小麦京冬1号（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．ｃｖ．Ｊｉｎｄｏｎｇ Ｎｏ．１）胚芽的ｍＲＮＡ为对照，通过减法杂交构建了富集冬小麦春化相关基因的ｃＤＮＡ文库，经过差异筛选分离到了一个仅在春化２１ｄ这一关键期表达，而在不春化、春化４ｄ、脱春化不表达的春化相关。ｃＤＮＡ克隆Ｖｒｃ７９。Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交及同源性分析表明它是一个在植物中新发现的不同于低温胁迫诱导基因的春化特异克隆，其对春化需求型植物的成花诱导可能起重要的调控作用。

植物基因克隆的策略和方法

植物基因克隆是当前植物学研究的前沿和热点。经过近 2 0年的发展 ,已经形成了一些克隆植物基因的方法 ,主要有功能克隆 ,PCR扩增 ,转座子或T DNA标签 ,定位克隆 ,差别杂交和减法杂交 ,mRNA差异显示和人工合成克隆。本文对这些技术的工作原理 。

菌落PCR差异筛选cDNA片段文库

目的探索菌落PCR差异筛选cDNA片段文库的可行性。方法在用抑制性PCR构建cDNA片段文库的同时,分别制备正、反向减法杂交探针并用碱性磷酸酶直接标记。随后用这些探针与菌落PCR的产物杂交,从而筛选出差异表达克隆,并再次用RT-PCR证实其差异表达。结果建立的菌落PCR反应体系经济实用,方法稳定,并成功地从500个克隆中筛选出差异表达克隆。结论菌落PCR可用于差异筛选构建于质粒载体的cDNA片段文库。

妊娠高血压综合征发病相关基因的克隆

目的 应用妊娠高血压综合征 (妊高征 )患者胎盘研究其发病相关基因 .方法 利用基于 PCR的改良消减杂交技术 ,首先建立了该病相关的 c DNA消减文库 .随机筛选出2 0个含有差异表达片段的克隆 ,经过反向点杂交 ,弃掉 6个假阳性克隆 ,确定 1 4个克隆为妊高征发病相关基因 .结果 经过序列测定和同源性比较 (BLAST) ,发现 1 1个为已知基因 ,其中 1号基因为 necdin家族基因 ;3个为新基因 .这 3个新基因已完成了全部插入片段的序列测定 ,并登录 Gen Bank,登录号为 AF2 32 2 1 6,AF2 32 2 1 7,AF2 33648.结论 妊高征患者胎盘基因表达谱和正常妊娠胎盘相比 ,发生改变 .

妊高征发病相关基因的克隆、序列测定及初步分析

目的 :克隆妊高征胎盘特异表达基因并阐述它在该病发病中的意义。方法 :以正常胎盘和妊高征胎盘为模型 ,利用基于PCR的改良消减杂交技术 ,建立与妊高征相关的cDNA消减文库。随机筛选出 2 0个含有差异表达片段的克隆备用。结果 :2 0个含有差异片段的克隆经过反向点杂交 ,弃掉 6个假阳性克隆 ,确定 14个克隆为妊高征发病相关基因。经过序列测定和局部相似性检索 (BLAST) ,发现 11个为已知基因 ,其中 1号基因为NECDIN家族基因 ;3个为新基因。这 3个新基因已完成了全部插入片段的序列测定 ,并已登录GeneBank ,登录号为AF2 32 2 16、AF2 32 2 17及AF2 33648。结论 :本研究首次报道了这些基因 (尤其是Necdin表达基因 )在妊高征中高表达 ,这有助于进一步探讨妊高征的病因。

SMART-SH技术的建立及应用

文章以构建的东北野生大豆盐胁迫全长cDNA文库为起始材料,通过将SMART方法与减法杂交相结合,首次初步建立了一种直接获取全长差异cDNA的技术,即SMART-SH技术,弥补了现有技术无法直接得到差异表达基因的全长序列这一不足。进一步讨论了该技术的优缺点,及其在构建全长差减cDNA文库上的优势和应用前景。

mRNA差示技术的原理及其应用

生物个体发育与基因有序的选择性表达有关,许多疾病的产生是由于基因表达不正常所致,因此确定细胞中基因表达差异是一项重要的研究课题。以往研究基因表达差异的方法主要包括:cDNA减法杂交和蛋白质双向电泳。cDNA减法杂交需要建立cDNA文库,通过两次杂交分离去除双链分子,再将单链分子同文库进行杂交。该法不仅技术复杂、费时,而且重复性较差。蛋白质双向电泳仅能粗略地比较两种细胞内表达的蛋白的差异,不能直接从基因水平分析鉴定。

树突状细胞特异表达新基因的大规模筛选

树突状细胞在抗原提呈过程中起极其重要的作用．为大规模筛选抗原刺激后人树突状细胞特异表达基因，建立了一种基于“长距离” Ｐ Ｃ Ｒ 技术的减法杂交技术，在实验中取得了较好的效果．初步测序分析了 ２００ 个插入片段为 ０７～２ ｋｂ 的克隆，结果发现新基因片段占 ５０％ ，其中 ３０％ 的片段包含基因编码区，１５％ 的片段包含完整编码区，打点杂交分析新基因中 ８０％ 为抗原刺激后树突状细胞所表达．从已知和未知基因中发现了一些与树突状细胞生物学功能可能相关的基因，这将有助于进一步揭示与阐明树突状细胞的生物学功能．更多及更长片段的测序工作正在进行中．

白细胞介素-17

一种由T细胞产生的蛋白被命名为白细胞介素-17(1L-17),它作用于多种细胞表达的受体,其序列首先是从活化T细胞的减法杂交获得的小鼠cDNA序列而被鉴定的,称为CTLA8。CTLA8与一种亲淋巴病毒Herpesvirus saimiri的开放读框13(HVS13)具有57％的同源性。无论是IL-17,还是其受体与已知细胞因子及细胞因子受体均无序列相似性。

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA,并将其相应的基因命名为OsPRP1.OsPRP1由2个外显子和1内含子组成,编码的蛋白由224个氨基酸残基组成,其中脯氨酸含量最高,占14.29％.该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽,一个N-端结构域和一个C-端结构域组成.C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列.Southern blot及序列分析结果表明,水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1,它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上.RT-PCR表明,OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高,在根和叶中有少量表达.用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中,OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达;该基因的表达有明显的时间特异性,在花粉母细胞中表达量最高,在单核期的小孢子中几乎不表达;在芽中,该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达.从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.

水稻花优势表达基因RA68的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻花中克隆了1个编码含丰富脯氨酸和苏氨酸结构域多肽的cDNA,其相应的基因命名为RA68.RA68含3个外显子和2个内含子,编码由219个氨基酸残基组成的蛋白质.数据分析结果显示,该蛋白由1个22个氨基酸残基组成的信号肽,1个亲水性的N-端结构域和1个疏水性的C-端结构域组成.N-端结构域是一段嵌合PTPTSYGmotif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列.Southernblot和序列分析结果表明,RA68在水稻基因组以单拷贝存在,定位于第2号染色体.Northern杂交结果表明,RA68在幼芽和花中表达量较高,在根和叶中不表达.花和幼芽进行原位杂交分析结果表明,在花中,RA68在花粉母细胞、二分体细胞、单核花粉粒以及大孢子囊中表达.基于该基因的表达特性及其编码蛋白质的结构特征,探讨了其在花发育中的可能功能.