电泳迁移率变动分析化学发光法检测T细胞NF-κB活性

目的:建立凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)化学发光法检测T细胞激活后核因子κB(NF-κB)活性的方法。方法:人外周血单个核细胞(PBMC)用抗CD3单克隆抗体(mAB)激活T细胞后,提取细胞核蛋白与生物素标记的NF-κB特异性探针结合,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至正电荷尼龙膜,加链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物后用X光胶片显影,检测NF-κB活性。结果:人PBMC用抗CD3 mAB刺激后15 m in,明显可见NF-κB活化,30 m in时达高峰,60 m in时降低。结论:EMSA化学发光法检测转录因子活性是一种较简捷和高灵敏度的技术,可用于检测T细胞活化后NF-κB活性变化。

核因子-κB电泳迁移率变动分析方法的改进

目的:建立一种快速、简化的电泳迁移率变动分析(EMSA)方法检测DNA结合蛋白核因子-κB(NF-κB)。方法:NF-κB的提取和浓度测定,32P标记探针,探针与核蛋白结合,电泳和放射自显影。结果:该法可获得背景干净、条带清晰整齐的图片,能直接目测NF-κB的活性。结论:改良的EMSA用于检测NF-κB更简便、实用、敏感性高,值得推广。

近红外荧光电泳迁移率变动分析的实验方法

目的:分析最新近红外荧光标记(NIRF)电泳迁移率变动分析(EMSA)技术的优缺点,在此基础上对NIRF-EMSA技术进行实验方法的改进。方法:设计了3种NIRF-EMSA实验方法,即扫胶法、染胶法和扫膜法,通过实验比较了3种方法的实验程序复杂性、优缺点及检测成本,并将3种方法与化学发光EMSA进行了比较。结果:采用3种方法都可以取得良好的EMSA检测效果,但比较而言,间接扫膜法不仅效果良好,而且实验成本最低。结论:间接扫膜法是值得推广应用的最经济便捷的基于Odyssey红外荧光成像系统的近红外荧光EMSA实验方法。

两种化学发光电泳迁移率变动分析技术的比较

采用DIG及Biotin标记寡核苷酸,研究了两种非放射性标记电泳迁移率变动分析的实验方法,即化学发光电泳迁移率变动分析实验(chemi-EMSA)的可靠性,并对两种标记体系的化学发光电泳迁移率变动分析实验进行了比较,以确立一种最佳的化学发光电泳迁移率变动分析实验技术。结果表明:通过对转录因子蛋白NF-κB的实验研究,两种标记体系均可以获得良好的电泳迁移率变动分析检测效果,其中“Biotin-streptavidin-HRP-ECL化学发光电泳迁移率变动分析”实验体系更好。

橡胶树HbCBF1蛋白的原核表达及其CRT结合活性分析(简报)

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis），是大戟科橡胶树属植物．原产于巴西亚马逊河流域，是典型的热带高大乔木．所生产的橡胶是天然橡胶的重要来源。在我国．橡胶树栽培区主要分布在北纬18°到24°．冬季常常遭到寒潮和冷空气的侵袭。30多年来的植胶历史证明．寒害是我国植胶区较为严重的自然灾害．是影响我国橡胶栽培的主要自然灾害之一。对橡胶树进行低温、抗寒生理研究，明确橡胶树的低温反应和抗寒机制．在理论和实践上都有重要意义。

EMSA法分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclin B1的相互作用

利用蛋白凝胶电脉迁移率变动分析法 (EMSA)分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclinB1的相互作用。探针位于cyclinB1启动子区的 - 783到 - 75 4之间 ,该区域包含SATAT5与cyclinB1的结合序列TTN5AA。STAT5与cyclinB1共形成a、b和c三条蛋白滞后带 ,当用点突变的探针作用时 ,仅剩下滞后带a和滞后带c 。

老年性痴呆相关基因nicastrin启动子区单核苷酸多态性分析

【目的】分析老年性痴呆(Alzheimer病)相关基因nicastrin启动子区单核苷酸多态性(SNP),探讨其基因表达可能的分子调控机制。【方法】扩增nicastrin基因ATG上游约1.0kp启动子区DNA片段,与萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic进行重组质粒的克隆与鉴定,确立启动子区候选功能SNP及其相应位点结合的转录调节因子。应用Lipofectamine 2000对包含功能SNP的重组质粒进行CRL-2137细胞瞬时转染,双荧光素酶相对活性分析及电泳迁移率变动分析。【结果】Nicastrin基因启动子区960 bp DNA片段内存在功能SNP_rs10752637-922 G→T,与其相应位点结合的转录因子为hepatic leukemia factor(HLF),SNP_rs10752637-922 T的序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较SNP_rs10752637 -922 G的序列结构强(P<0.05,n=3)。【结论】Nicastrin基因核心启动子应该在960 bp DNA片段内,SNP_rs10752637-922 G→T可能是启动子区有功能位点突变,包含rs10752637-922 G/T的核苷酸序列结构可能通过与HLF在内的转录调节因子的作用来实现对nicastrin基因表达差异的调控。

EMSA法分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclin D1的相互作用

利用蛋白凝胶电脉迁移率变动分析法 (EMSA)分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclinD1的相互作用。探针位于cyclinD1启动子区的 - 2 48到 - 2 2 0之间 ,该区域包含SATAT5与cyclinD1的结合序列TTN5AA。STAT5与cyclinD1共形成a、b两条蛋白滞后带 ,当用点突变的探针作用时 ,仅剩下滞后带a。

人A4GNT基因5'调控区的结构和功能分析

为探索人α1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α1,4-N-acetylglucosaminyltransferase,A4GNT)基因表达的调控机制,应用5'cDNA末端快速扩增法和引物延伸法确定了A4GNT基因的转录起始位点.在生物信息学分析的基础上,构建了系列5'缺失荧光素酶报告基因载体和定点突变载体.瞬时转染胃癌细胞MKN45和AGS.荧光素酶活性分析表明,A4GNT基因转录的核心启动子在-141bp～+116bp区域,该区域缺乏典型的TATA盒,但含有CCAAT盒、Sp1和ETS-1等转录因子潜在结合位点.突变分析显示,-136bp～-131bp的Sp1结合位点及-93bp～-89bp正向CCAAT序列对A4GNT启动子转录激活至关重要.电泳迁移率变动分析表明,这两个顺式作用元件能够与转录因子Sp1和NF-Y结合.另外,在-1464bp～-771bp区域可能含有与基因的特异性表达相关的调控元件.

琼脂糖凝胶厚度对DNA电泳的影响

目的研究不同厚度的琼脂糖凝胶对电泳的影响。方法用扩增得到的产物进行不同厚度的琼脂糖凝胶电泳,溴化已锭染色成像并求出进行相对迁移率等相关分析。结果迁移距离5-7 mm厚度凝胶时最大;10 mm以内相对迁移率随着凝胶厚度的增加而增大,10 mm以上相对迁移率反而降低;电泳图像以3-10 mm 较好。结论5-7 mm厚度的琼脂糖凝胶进行电泳较合适。

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.

八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导大鼠肺组织NF-κB活性增高的抑制作用

目的与方法 :为探讨八肽胆囊收缩素 (CCK - 8)防治内毒素引起急性肺损伤的分子作用机理 ,用电泳迁移率变动分析技术 (EMSA) ,观察CCK - 8对脂多糖 (LPS)诱导核转录因子κB(NF -κB)活性变化的影响 ,用光密度扫描电泳谱带峰面积积分值表示NF -κB活性 ,观察肺组织的病理学变化。结果 :LPS入血可以明显引起大鼠肺组织的NF -κB活性 16 39 92± 198 6 3(P <0 0 1) ,显著高于对照组 (5 93 5 6± 89 34) ,此作用为预先静脉注入CCK - 8部分逆转 ,NF -κB活性低至 82 3 91± 97 32 (P <0 0 1) ,CCK - 8可减轻LPS引起的肺组织病理学变化。结论 :CCK -8对LPS激活肺组织NF

抗人TNF单克隆抗体对TNF诱导的NF-κB核转位的抑制作用

目的 :鉴定 3株抗人TNF单克隆抗体 (mAb)D2、E6和F6对TNF诱导的NF κB核转位的抑制作用。方法 :将不同浓度的 3株mAb及无关mAb分别与TNF溶液孵育后 ,加入到ECV30 4细胞培养液中。孵育 1h后收获细胞 ,从中提取核蛋白并测定其含量 ,用电泳迁移率变动分析 (EMSA)检测核提取液中NF κB的核转位。结果 :3株抗TNFmAb均可抑制TNF诱导的ECV30 4细胞中NF κB的核转位。其中mAbD2的抑制作用最强 ,其次为mAbF6和E6 ,无关对照抗体也有一定的非特异性反应。抑制作用与加入的mAb呈良好的剂量依赖关系 ,在 10mg/L和 0 .1mg/L条件下 ,mAbD2的抑制率分别为 94 .2 %和75 .1% ,mAbE6分别为 6 4 .9%和 2 8.6 % ,mAbF6分别为 70 .3%和 4 9.5 % ,无关对照抗体分别为 2 0 .0 %和 11.1%。结论 :mAbD2、E6和F6可特异性地抑制TNF诱导的NF κB核转位 。

不同剂量X射线照射对小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB的影响

目的 :观察不同剂量 X射线照射对小鼠腹腔巨噬细胞转录因子 NF- κB的影响。方法 :用凝胶电泳迁移率变化分析法得到电泳带 ,用 Phosphor Imager扫描仪分析数据。结果 :0 .0 75 GyX射线全身照射后 4h开始小鼠腹腔巨噬细胞 NF- κB的 DNA结合活性逐渐升高 ,48h时基本恢复到假照水平 ,2 .0 0 0 Gy X射线全身照射后小鼠腹腔巨噬细胞 NF- κB的 DNA结合活性从 8h开始上升 ,持续到 48h。结论 :低剂量和较高剂量 X射线均能诱导小鼠腹腔巨噬细胞中的转录因子NF-κB。

抑制NF-κB活性对糖尿病大鼠肾脏TGF-β1 mRNA表达影响

目的 研究抑制核因子 κB(NF κB)活性对糖尿病大鼠肾脏TGF β1mRNA表达影响。 方法 纯种♂Wistar大鼠分为 3组 :A组为正常对照组 (11只 ) ,B组为糖尿病大鼠未干预组 (11只 ) ,C组为糖尿病大鼠PDTC(NF κB活性抑制剂 )干预组 (9只 )。饲养 18wk后取出肾脏 :以电泳迁移率变动分析技术检测肾组织NF κB活性 ,透射电镜检测肾小球基底膜厚度及系膜基质密度 (系膜基质面积 /系膜面积 ) ,RT PCR检测TGF β1mRNA表达。酶免疫分析法检测 2 4h尿白蛋白排泄 (UAE)。结果 肾组织NF κB活性在B组大鼠肾组织 (1 85± 0 5 4× 10 6)显著高于A组 (0 0 7± 0 11×10 6,P <0 0 1) ,C组 (0 2 5± 0 2 5× 10 6)显著低于B组 (P <0 0 1)。B组与A组比较 ,UAE (2 18± 1 98mgvs 0 4 1± 0 4 7mg,P <0 0 1)、肾小球基底膜厚度 (5 31 6± 10 7 6nmvs 312 4±2 5 4nm ,P <0 0 1)及系膜基质密度 (5 6 4 1± 6 78vs 33 95±5 2 2 ,P <0 0 1)均显著增高 ;C组大鼠UAE(0 5 6± 0 72 )mg、肾小球基底膜厚度 (315 8± 2 1 4 )nm及系膜基质密度 (37 97±7 37)均显著低于B组 (均P <0 0 1)。肾组织TGF β1mR NA表达在B组大鼠 (0 5 3± 0 2 0 )显著高于A组 (0 2 6±0 13,P <0 0 1) ,C组 (0 2 9± 0 10 )显?

右美托咪定对创伤后应激障碍大鼠核因子κB抑制蛋白激酶/核因子κB抑制蛋白α/核因子κB通路及认知功能障碍的影响

目的探讨右美托咪定(DEX)对创伤后应激障碍大鼠(PTSD)核因子κB抑制蛋白激酶(IKK)/核因子κB抑制蛋白α(IκBα)/核因子κB(NF-κB)通路及认知功能障碍的影响。方法将大鼠按照随机数字表法分为空白对照(control)组、模型(model)组、阳性对照(positive)组和DEX组。除control组外,其余各组使用单一延长应激法(SPS)构建PTSD模型,并于模型制作后分别给予相应药物。旷场实验和Morris水迷宫法检测大鼠自主活动和学习记忆能力;HE染色法观察大脑皮层和海马组织病理变化;ELISA和Western blotting检测海马组织白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量及IKK、IκBα、嘌呤能离子通道型受体7(P2X7R)和富含亮氨酸重复结构域蛋白3(NALP3)表达水平;凝胶电泳迁移率转变分析(EMSA)评价NF-κB活性。结果与control组相比,model组大鼠大脑皮层及海马CA1区出现结构紊乱,细胞核固缩等病理变化,大鼠自主活动和学习记忆能力降低(P<0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α含量、IKK、IκBα、P2X7R和NALP3表达水平及NF-κB活性升高(P<0.05);与model组相比,positive组和DEX组大鼠大脑皮层及海马CA1区病理现象缓解,上述指标变化均与model组相反(P<0.05)。结论DEX可显著提高PTSD大鼠自主活动和学习记忆能力,减少海马组织炎症反应,改善认知功能障碍,可能与下调IKK/IκBα/NF-κB通路有关。

NKX3.1基因上游一个30bp负调控区结合蛋白的初步鉴定

目的:鉴定NKX3.1基因上游30bp负调控区的结合蛋白。方法:人工合成30bp负调控序列,用末端转移酶对其进行地高辛标记;提取细胞核蛋白,采用电泳迁移率变动分析(EMSA)方法,检测细胞核提取液中与30bp负调控序列特异结合的核蛋白。结果:在LNCaP细胞及其他不同肿瘤细胞系核提取液中,检测到与30bp负调控序列特异结合的核蛋白,但在不同的细胞系中有不同种类的结合蛋白。结论:NKX3.1基因上游的30bp负调控机制在不同的细胞中普遍存在,不同的细胞核中有不同的结合蛋白,可能涉及不同的调控机理。

重组腺病毒IκBαM抑制高糖诱导的血管内皮细胞炎症因子的异常分泌

构建携有核因子κB抑制物IκBα的突变体IκBαM的重组腺病毒(AdIκBαM),并感染ECV304血管内皮细胞,采用Westem blot、电泳迁移率变动分析和逆转录-聚合酶链反应等方法研究核因子κB在高浓度葡萄糖刺激的ECV304细胞分泌功能中所起的作用以及阻断其活性对内皮细胞分泌功能的影响。结果发现,高糖能诱导ECV304细胞IκBα的降解和核因子κB的激活,同时上调炎症因子细胞间粘附分子1、单核细胞趋化蛋白1和内皮素1 mRNA表达水平,而感染AdIκBαM的ECV304/IκBαM细胞则能拮抗高糖所致的IκBα降解与核因子κB激活,同时下调这些炎症因子的异常分泌水平。结果提示,核因子κB的激活在高糖所致的内皮细胞分泌功能改变中起中轴作用,抑制核因子κB的活化,有助于改善血管内皮细胞功能。

原花青素抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞PGE_2生成的机制

目的:观察原花青素对脂多糖诱导RAW264.7细胞PGE2生成的影响及其作用机制。方法:放射免疫法(RIA)检测原花青素对脂多糖诱导的RAW264.7细胞PGE2生成的影响;LPS诱导RAW264.7细胞9h,再加不同浓度原花青素作用30min,放射免疫(RIA)法检测原花青素对COx-2酶活性的影响;半定量逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)法检测原花青素对COx-2 mRNA表达的影响;提取核蛋白,蛋白免疫印迹(western blot)法检测原花青素对NF-κB/p65蛋白表达的影响;电泳迁移率变动分析(EMSA)法检测原花青素对NF-κB与DNA结合活性的影响。结果:0.8,4和20mg·L-1原花青素抑制LPS诱导RAW264.7细胞PGE2生成;0.8,4和20mg·L-1原花青素不影响LPS诱导RAW264.7细胞COx-2酶活性;0.8,4和20mg·L-1原花青素下调LPS诱导RAW264.7细胞COx-2 mRNA表达;4,20mg·L-1原花青素下调LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB/p65蛋白表达;0.8,4和20mg·L-1的原花青素可明显降低LPS诱导下RAW264.7细胞的NF-κB活化。结论:原花青素显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞PGE2生成的作用与原花青素抑制COx-2 mRNA表达有关,此作用可能是通过抑制NF-κB/p65蛋白表达和抑制NF-κB的DNA结合活性来实现。

核转录因子κB在大鼠全脑缺血耐受中的表达及意义

目的:探讨核转录因子кB(NFкB)在大鼠全脑缺血耐受中的表达及其意义。方法:建立大鼠四血管闭塞的全脑缺血耐受模型,将实验动物随机分为6组:缺血预处理组(IP),DTTC(NFкB的特异性抑制剂)加缺血预处理组(IP^(DTTC)),缺血再灌注组(I/R),缺血预处理加缺血再灌注组(IP+I/R),DTTC加缺血预处理组加缺血再灌注组(IP^(DTTC)+I/R),假手术组(sham)。各组行海马神经元计数,并用凝胶电泳迁移率改变分析法检测NFкB活性。结果:IP和I/R中NFкB均被激活;IP+I/R组与I/R组相比,神经元计数明显增高;DTTC可抑制NFкB活性,也抑制IP的神经保护作用。结论:IP可通过激活NFкB发挥神经保护作用。