电泳迁移率变动分析化学发光法检测T细胞NF-κB活性

目的:建立凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)化学发光法检测T细胞激活后核因子κB(NF-κB)活性的方法。方法:人外周血单个核细胞(PBMC)用抗CD3单克隆抗体(mAB)激活T细胞后,提取细胞核蛋白与生物素标记的NF-κB特异性探针结合,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至正电荷尼龙膜,加链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物后用X光胶片显影,检测NF-κB活性。结果:人PBMC用抗CD3 mAB刺激后15 m in,明显可见NF-κB活化,30 m in时达高峰,60 m in时降低。结论:EMSA化学发光法检测转录因子活性是一种较简捷和高灵敏度的技术,可用于检测T细胞活化后NF-κB活性变化。

改良EMSA法分析人α1(Ⅰ)胶原基因序列特异性DNA结合蛋白

目的 :分析人α1( )胶原基因 5′侧翼区具有较高启动调控活性序列的 DNA结合蛋白。方法 :以原代培养人瘢痕皮肤成纤维细胞为胶原产生细胞 ,采用限制性内切酶消化、DNA混合片段末端标记和增强化学发光的改良电泳迁移率改变实验(EMSA)分析人 α1( )胶原基因 5′侧翼区 - 2 6 8～ + 42 bp序列 DNA结合蛋白。结果 :在胶原产生细胞——人瘢痕成纤维细胞中存在 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列的 DNA结合蛋白 ,其结合活性具有特异性 ,并能被 Sp- 1,NF- 1,NF- κB识别序列所竞争。结论 :改良 EMSA法可用于分析较长序列的 DNA结合蛋白 ,人 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列中存在转录因子Sp- 1,NF- 1,NF- κB结合序列 ,这些转录因子结合位点可能与人 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列的高启动活性有关。

琼脂糖凝胶厚度对DNA电泳的影响

目的研究不同厚度的琼脂糖凝胶对电泳的影响。方法用扩增得到的产物进行不同厚度的琼脂糖凝胶电泳,溴化已锭染色成像并求出进行相对迁移率等相关分析。结果迁移距离5-7 mm厚度凝胶时最大;10 mm以内相对迁移率随着凝胶厚度的增加而增大,10 mm以上相对迁移率反而降低;电泳图像以3-10 mm 较好。结论5-7 mm厚度的琼脂糖凝胶进行电泳较合适。

银染法用于EMSA分析检测三链核酸形成

目的 探讨银染法在三链形成的电泳迁移率改变分析 (EMSA)中的可行性 ,从而为三链核酸研究提供有效的非同位素检测方法。 方法 三链形成反应后进行 EMSA分析 ,然后用银染显示电泳形成的 DNA区带。 结果 银染法显示出三链的 EMSA滞后带 ,并揭示三链形成的平台效应。 结论 本文首次表明银染法可用于三链形成的 EMSA分析快速检测 ,且 SOX9基因内含子

细胞间粘附分子表达调控的实验研究

目的探讨血管内皮细胞激活表达细胞间粘附分子(ICAM-1),及核因子-κB(NF-κB)对其表达调控的作用。方法通过建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外培养,观察TNFα刺激HUVEC后,采用凝胶电泳迁移率改变分析法检测NF-κB活化强度和应用免疫组化方法检测HUVEC表达ICAM-1。结果HUVEC受TNFα刺激后2～12hNF-κB的活性显著增高(P<0.01),峰值在刺激后6h;同时ICAM-1表达显著增强(P<0.01),并于12h达峰值,NF-κB活化与ICAM-1表达之间有峰值水平和时间顺序的正相关。且NF-κB可与含ICAM-1基因的κB序列的寡聚核苷酸系列特异结合;竞争抑制实验进一步证实了NF-κB与标记的κB系列结合的特异性;超迁移试验表明,与κB系列结合的NF-κB是由P65亚基构成的同源二聚体。结论TNFα可有效地激活HUVEC高效表达ICAM-1,其表达受P65亚基同源二聚体构成的NF-κB调控。

核转录因子κB在大鼠全脑缺血耐受中的表达及意义

目的:探讨核转录因子кB(NFкB)在大鼠全脑缺血耐受中的表达及其意义。方法:建立大鼠四血管闭塞的全脑缺血耐受模型,将实验动物随机分为6组:缺血预处理组(IP),DTTC(NFкB的特异性抑制剂)加缺血预处理组(IP^(DTTC)),缺血再灌注组(I/R),缺血预处理加缺血再灌注组(IP+I/R),DTTC加缺血预处理组加缺血再灌注组(IP^(DTTC)+I/R),假手术组(sham)。各组行海马神经元计数,并用凝胶电泳迁移率改变分析法检测NFкB活性。结果:IP和I/R中NFкB均被激活;IP+I/R组与I/R组相比,神经元计数明显增高;DTTC可抑制NFкB活性,也抑制IP的神经保护作用。结论:IP可通过激活NFкB发挥神经保护作用。

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.

不同剂量X射线照射对小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB的影响

目的 :观察不同剂量 X射线照射对小鼠腹腔巨噬细胞转录因子 NF- κB的影响。方法 :用凝胶电泳迁移率变化分析法得到电泳带 ,用 Phosphor Imager扫描仪分析数据。结果 :0 .0 75 GyX射线全身照射后 4h开始小鼠腹腔巨噬细胞 NF- κB的 DNA结合活性逐渐升高 ,48h时基本恢复到假照水平 ,2 .0 0 0 Gy X射线全身照射后小鼠腹腔巨噬细胞 NF- κB的 DNA结合活性从 8h开始上升 ,持续到 48h。结论 :低剂量和较高剂量 X射线均能诱导小鼠腹腔巨噬细胞中的转录因子NF-κB。

青蒿素对糖尿病大鼠肾组织NF-κB的DNA结合活性升高的抑制作用

目的探讨青蒿素对实验性糖尿病大鼠肾组织核因子-κB(NF-κB)的DNA结合活性升高的抑制作用。方法选择雄性SD大鼠15只,随机分成正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)及青蒿素治疗组(C组),采用腹腔单剂量注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg方法建立糖尿病大鼠模型。C组给予青蒿素300 mg/(kg·d)腹腔注射。于实验第4周应用电泳迁移率改变分析(EMSA)法检测3组大鼠肾皮质细胞NF-κB的DNA结合活性,并观察实验大鼠肾脏的病理学变化。结果 B组大鼠肾细胞NF-κB的DNA结合活性显著上调;C组NF-κB的DNA结合活性显著较B组下降,肾脏组织的病理学损伤亦减轻。结论青蒿素可明显改善糖尿病大鼠肾脏组织病理学改变,通过抑制糖尿病大鼠肾脏组织细胞NF-κB的DNA结合活性上调可能是相关作用机制之一。

活血承气汤对小肠缺血再灌注家兔小肠及肺组织NF-κB活性的影响

目的:观察和探讨应用活血承气汤(HXCQ)对小肠缺血再灌注家兔小肠及肺组织NF-κB活性的影响。方法:建立小肠缺血再灌注家兔模型,采用电泳迁移率改变分析方法(electrophoretic mobility shiftassay,EMSA),分析活血承气汤灌胃后不同时段小肠缺血再灌注家兔小肠以及肺组织NF-κB活性的变化。结果:应用活血承气汤后小肠缺血再灌注家兔小肠和肺组织NF-κB活性显著降低。结论:应用活血承气中药可显著减轻小肠缺血再灌注引起的小肠及肺组织损伤。

CRE-decoy ODN对大鼠吗啡戒断症状的抑制作用

目的研究以转录因子CREB为靶点的CRE-decoy ODN对大鼠吗啡戒断症状的影响。方法合成全硫代磷酸化ODN。实验分为5组:0.9%氯化钠溶液对照组,侧脑室0.9%氯化钠溶液注射对照组,吗啡依赖组,吗啡戒断组,吗啡戒断CRE-decoy ODN治疗组。制备吗啡身体依赖模型:采用递增剂量皮下注射吗啡建立大鼠吗啡身体依赖模型。0.9%氯化钠溶液对照组和侧脑室0.9%氯化钠溶液注射对照组大鼠注射等体积0.9%氯化钠溶液。对吗啡戒断治疗组大鼠在末次吗啡注射前30h,每只大鼠于左侧侧脑室内注射CRE-decoy ODN 20μg,侧脑室0.9%氯化钠溶液注射对照组、吗啡依赖组和吗啡戒断组每只大鼠则于左侧侧脑室内注射等体积0.9%氯化钠溶液。吗啡戒断大鼠的行为学评定:腹腔注射纳络酮后,由不知情的观测者随即观测大鼠的戒断行为,每15分钟为一时间段,连续观测1h内上述行为的发生频率,最后计算戒断0～60min的总评分。进行体重丢失的戒断评分:体重丢失百分率(ΔW)=纳络酮注射前与注射1h后的体重差/纳络酮注射前体重×100%。结果 CRE-decoy ODN明显抑制吗啡戒断大鼠0～60min戒断症状的总评分,使其从(24.0±0.7)分降至(15.0±0.9)分(P<0.01)。CRE-decoy ODN明显抑制吗啡戒断大鼠0～60min的体重丢失,反映戒断症状综合性指标的体重丢失百分率ΔW从(7.2±1.2)%降至(4.1±0.8)%(P<0.01)。结论 CRE-decoy ODN明显减轻吗啡戒断大鼠的戒断症状。

右美托咪定对创伤后应激障碍大鼠核因子κB抑制蛋白激酶/核因子κB抑制蛋白α/核因子κB通路及认知功能障碍的影响

目的探讨右美托咪定(DEX)对创伤后应激障碍大鼠(PTSD)核因子κB抑制蛋白激酶(IKK)/核因子κB抑制蛋白α(IκBα)/核因子κB(NF-κB)通路及认知功能障碍的影响。方法将大鼠按照随机数字表法分为空白对照(control)组、模型(model)组、阳性对照(positive)组和DEX组。除control组外,其余各组使用单一延长应激法(SPS)构建PTSD模型,并于模型制作后分别给予相应药物。旷场实验和Morris水迷宫法检测大鼠自主活动和学习记忆能力;HE染色法观察大脑皮层和海马组织病理变化;ELISA和Western blotting检测海马组织白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量及IKK、IκBα、嘌呤能离子通道型受体7(P2X7R)和富含亮氨酸重复结构域蛋白3(NALP3)表达水平;凝胶电泳迁移率转变分析(EMSA)评价NF-κB活性。结果与control组相比,model组大鼠大脑皮层及海马CA1区出现结构紊乱,细胞核固缩等病理变化,大鼠自主活动和学习记忆能力降低(P<0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α含量、IKK、IκBα、P2X7R和NALP3表达水平及NF-κB活性升高(P<0.05);与model组相比,positive组和DEX组大鼠大脑皮层及海马CA1区病理现象缓解,上述指标变化均与model组相反(P<0.05)。结论DEX可显著提高PTSD大鼠自主活动和学习记忆能力,减少海马组织炎症反应,改善认知功能障碍,可能与下调IKK/IκBα/NF-κB通路有关。

乳腺癌组织中STAT3激活的意义

目的:分析STAT3在乳腺癌及癌旁乳腺组织中的激活水平与乳腺癌临床分期的关系,探讨STAT3在乳腺癌发病机制中的作用. 方法:乳腺癌手术标本36例,免疫组化SP法检测STAT3蛋白在乳腺癌组织中的表达;凝胶迁移电泳率实验测定STAT3在乳腺癌及癌旁乳腺组织中的激活水平.结果:在临床ⅡA,ⅡB和ⅢA期乳腺癌组织中STAT3激活水平均明显高于同期癌旁乳腺组织(P均<0. 01 ),ⅡA,ⅡB和ⅢA期乳腺癌组织中STAT3激活水平无显著差异(P>0. 05);STAT3蛋白主要表达于细胞质和细胞核. 结论:STAT3可能在乳腺癌的发生发展中有重要的作用;抑制STAT3的激活可能成为治疗乳腺癌的一种新的途径.

吡咯烷二硫代氨基甲酸盐对大鼠急性坏死性胰腺炎肝损伤的保护作用

目的:探讨核因子KB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)的预防治疗作用。方法:大鼠80只随机分为正常对照组(Z)、胰腺炎组(Y)和干预纽.干预组又分为建模前1h PDTC干预组(A)、建模后1h PDTC干预组(B)和建模后6h干预组(C).干预组按不同时间ip PDTC.建模后6,12,24 h分批处死,临床全自动生化仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)和淀粉酶(AMY),用凝胶迁移率改变分析法(EMSA)测定胰腺和肝脏中NF-κB的活性.同时观察胰腺和肝脏的病理改变.结果:正常大鼠组织中几乎测不到NF-κB的活性,与Z组比较,Y组胰腺和肝脏组织中6,12,24 h NF-κB活性分别明显增加(P<0.001).建模前1h,1h后使用PDTC,胰腺和肝脏组织中NF-κB活性均受到抑制(18.14±3.30,23.79±3.62 vs 24.82±4.57:10.68±2.51,13.83±2.70 vs 16.38±2.50;P<0.05),Y组血清ALT,AMY均高于对照组.病理学检查可以见到Y组和A,B,C组的胰腺和肝脏均有炎性改变,但A组较Y组明显为轻.结论:NF-κB的异常活化与SAP以及肝损伤有明显关系:PDTC对SAP时肝损伤的发生有一定的预防作用.

青蒿素对糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性升高的抑制作用

目的探讨青蒿素对实验糖尿病大鼠肾组织转录因子活化蛋白-1(AP-1)的DNA结合活性升高的抑制作用。方法将75只实验大鼠分成正常对照组(A组)、糖尿病非治疗组(B组)及青蒿素治疗组(C组),B、C组应用腹腔单剂量注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg建立糖尿病大鼠模型。C组给予腹腔注射青蒿素300 mg/(kg·d)。于实验进行到第4周时处死各组大鼠,取部分右肾皮质,应用电泳迁移率改变分析(EMSA)法观察青蒿素对实验糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性的影响,并制备病理切片以观察肾组织的病理学变化。结果 B组大鼠肾细胞AP-1的DNA结合活性较A组显著上升,C组大鼠对肾细胞AP-1的DNA结合活性有显著抑制作用,并显著改善糖尿病大鼠肾脏组织的病理变化。结论青蒿素通过下调糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性上调而改善糖尿病大鼠肾脏组织病理改变。

活血承气合剂对小肠缺血再灌注家兔小肠及肺组织NF-κB活性的影响

目的观察和探讨应用活血承气中药对小肠缺血再灌注家兔小肠及肺组织NFκB活性的影响。方法建立小肠缺血再灌注家兔模型,采用电泳迁移率改变分析方法(electrophoreticmobilityshift assay,EMSA),分析服用活血承气合剂后不同时段小肠缺血再灌注家兔小肠以及肺组织NFκB活性的变化。结果应用活血承气中药后小肠缺血再灌注家兔小肠和肺组织NFκB活性显著降低。结论应用活血承气中药可显著减轻小肠缺血再灌注引起的小肠及肺组织损伤。

转录因子CREB激活介导吗啡依赖SK-N-SH细胞的nNOS及fosB基因表达的调控机制

目的 探讨吗啡依赖的SK- N -SH细胞表达神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase ,nNOS)及fosB基因的调控机制。方法 建立吗啡依赖及戒断细胞模型 ,体外合成含cAMP反应元件 (cAMPresponseelement ,CRE)序列的寡核苷酸 ,经硫代磷酸化修饰 ,作为单链寡核苷酸 (CRE transcriptionfactordecoyoligodeoxynucleotide ,CRE decoyODN)。分别采用电泳迁移率改变分析 (electrophoresismobilityshiftassay ,EMSA)及RT -PCR技术 ,检测CRE decoyODN对吗啡依赖及纳络酮急性戒断诱导的CREB的DNA结合活性、nNOS及fosBmRNA表达的影响。结果 吗啡依赖及纳络酮急性戒断使SK- N- SH细胞的CREB的DNA结合活性、nNOS及fosBmRNA明显升高 ,CRE decoyODN可特异抑制上述指标升高。结论 CREB的激活介导了吗啡依赖SK- N

hPOT1基因过表达对HeLa细胞细胞周期和凋亡的影响

目的观察人POT1(protectionoftelomeres1)基因过表达对HeLa细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。方法利用本课题组构建的hPOT1基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;通过RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测外源基因的表达效果,流式细胞术分析细胞周期,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。结果pcDNA3-hPOT1重组质粒转染HeLa细胞48h后,mRNA和蛋白质分析表明,外源性hPOT1基因能在HeLa细胞中有效表达,HeLa细胞阻滞于细胞周期S期,而对凋亡无明显影响。结论hPOT1基因可能参与了高等真核细胞细胞周期调控过程,但与细胞凋亡无密切关系。

23份豌豆材料过氧化物酶同工酶研究

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对23份不同地区来源的豌豆进行过氧化物酶同工酶分析。通过对各供试材料酶谱特征和相似系数的分析,探讨供试材料间的亲缘关系。结果表明:不同地区来源的豌豆材料过氧化物同工酶在酶带数、酶量、酶活性等方面存在差异,供试材料中共出现161条酶带,14种类型,2条共有表达酶带。酶带数量在品种间差异显著,其中最多者出现8条,最少5条,Rf值范围为0.13~0.83。各个豌豆材料间的遗传相似度在0.33~1.00之间,过氧化物酶同工酶酶谱聚类分析将23份豌豆材料分为5个类群,分类结果与品种的来源和地理位置有一定的相关性,其中3号与17号材料、8号与16号材料、12号与13号材料亲缘关系相互最近;6号材料与其他材料的亲缘关系较远。