凝胶过滤层析结合液相色谱-串联质谱法测定血清中游离甲状腺激素

基于凝胶过滤层析(GFC)进行前处理,结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)建立了血清中游离三碘甲腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)的高通量、高灵敏检测新方法。选用Sephadex LH-20凝胶小柱对150μL血清样本进行过滤分离,先用Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.4)淋洗去除结合蛋白的甲状腺激素,然后用甲醇对游离的甲状腺激素进行洗脱,采用LC-MS/MS法进行检测和定量,并进行方法学验证。结果显示:FT3和FT4的线性相关系数(r^(2))均不小于0.9995,批内及批间相对标准偏差为1.8%~10%,准确度为85.4%~110%,基质效应为85.8%~114%,回收率为85.8%~107%。采用该方法与平衡透析法(ED)同时检测了95份血清样本,使用IBM SPSS Statistics 26和MedCalc统计软件(v.20.0.0)对检测结果进行配对t检验分析、PassingBablok回归分析和Bland-Altman一致性分析。结果表明,GFC/LC-MS/MS与ED/LC-MS/MS法对血清中FT3、FT4的测定结果无统计学差异(P>0.05)。所建立的方法快速、简便,受干扰因素相对较少,便于临床推广,可为临床实验室游离甲状腺激素的快速、高效、准确检测提供参考方法,同时为其它游离激素的检测提供了一种新的思路。

凝胶过滤层析参数对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响

考察了凝胶过滤介质、层析柱直径、柱床高度和洗脱流速对家蝇Muscadomestica蛋白粗提液分离效果的影响 ,结果表明 :凝胶过滤介质种类、层析柱直径、柱床高度、洗脱流速均能不同程度地影响家蝇蛋白粗提液的分离效果。在实验范围内 ,选择1 3cm直径、4 0cm柱床高度的SephadexG 75 ,以 0 4mL min的流速洗脱时 ,对家蝇蛋白粗提液的分离效果比较理想。

凝胶过滤层析分离蛋白质实验中三种过滤介质分离效果的比较

目的 探讨凝胶过滤层析分离蛋白质的最佳实验效果。方法 分别采用不同规格的凝胶过滤层析介质SephadexG 5 0、G 75、G 10 0 ,通过凝胶过滤层析法分离已知分子量的混合蛋白质。结果 混合样品得到分离 ,呈现三组分离样品的层析图。结论 从大分子物质中除去小分子物质时应选用交联度大的介质G 5 0。进行中等蛋白质分离时 ,选用G 75较为合适。将小分子物质浓缩而除去大分子物质时 ,应选用交联度小的介质 ,如G 10 0或G 2 0 0。

凝胶过滤层析在低聚木糖分离中的应用

分别以聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P-4和Bio-Gel P-2为分离介质,对低聚木糖进行二次分离,分析了凝胶过滤层析分离低聚木糖的规律。结果表明:采用Bio-Gel P-4一次分离可获得木二糖、木三糖、木五糖、木六糖和木七糖组分的纯度分别为98.18%,88.54%,97.52%,78.80%和86.67%;HPLC分析表明,低聚木糖中阿拉伯糖基质量分数为14.75%,其中木二糖和木三糖组分不含阿拉伯糖基;以Bio-Gel P-2为层析介质对木三糖组分进行了二次分离,可将木三糖组分的纯度从88.54%提高到94.19%。

凝胶过滤层析对针刺全血清成分的分段分离研究

目的 为进一步分离、鉴定针刺血清中存在的有效成分 ,对针刺全血清进行预初分段分离。方法 采用凝胶过滤层析技术对针刺全血清进行分段分离 ,并将分离的血清经冷冻干燥制成干粉。结果 将针刺全血清分成 >4 5 k D、14 .3k D- 4 5 k D和 <14 .3k D 3个分子量段。结论 有利于进一步确定针刺血清中抗哮喘有效成分的大体所在 。

凝胶过滤层析法调节脂质体内外水相pH的探讨

通过对脂质体内外水相pH梯度的制备方法的探讨,采用凝胶过滤层析技术将脂质体外水相的pH4.0柠檬酸缓冲液替换成pH 7.2磷酸盐缓冲液,在脂质体内外水相形成pH梯度。在药脂比为1∶5、1∶10、1∶15和1∶20(质量比)时,阿霉素在pH梯度的驱动下从脂质体外水相穿越脂质双分子膜进入内水相,包封率分别达到96.7%、98.7%、96.8%和95.1%,其中药脂比1∶10时包封率达到最高。药脂比1∶10制备的阿霉素脂质体在37℃,12 h内阿霉素泄漏均低于1.0%;48 h内药物泄露率低于5.0%。通过该实验,使学生们能够观测到如何采用凝胶过滤层析技术调节pH梯度,以及pH梯度在阿霉素脂质体主动载药过程中的重要性,为脂质体递释系统的课堂理论教学奠定了良好的实验基础。

RGD-葡激酶的凝胶过滤层析法复性及其纯化

构建的溶栓和抗栓双重功能的RGD 葡激酶突变体 (RGD Sak)在大肠杆菌中高表达 ,目的蛋白质以包涵体形式存在。为获得有活性的蛋白质 ,需要对包涵体进行变复性。利用凝胶层析方法对包涵体中RGD Sak进行复性 ,并与稀释复性法进行比较 ,发现凝胶柱复性方法具有操作周期短、简便、成本低而高效等优点。复性后蛋白质用Q SepharoseFF离子交换进一步纯化 ,纯度达 95 % ,酪蛋白凝胶板活性测定表明两种复性法得到的蛋白质比活性相当。圆二色谱测定显示两种复性法得到的蛋白质的二级结构成份和谱形一致 ,说明在两种复性过程中完成了RGD

凝胶过滤层析参数对EV71病毒粗提液分离效果的影响

通过凝胶过滤层析达到分离纯化EV71肠道病毒粗提液,以提高EV71的纯度。选用不同的洗脱流速、不同样品上样量、不同的缓冲溶液的pH值和不同盐浓度对EV71肠道病毒粗提液进行连续洗脱。结果表明,凝胶过滤层析的洗脱流速、样品上样量、缓冲溶液的pH值和盐浓度对EV71病毒均能不同程度地影响EV71病毒粗提液的分离效果。在试验范围内,选择洗脱流速为60 cm·h-1、样品的上样量为5%CV、缓冲溶液的pH为7.5和盐浓度为0.1 mol·L-1时,对EV71病毒粗提液的分离效果比较理想。

凝胶过滤层析精制还原型谷胱甘肽的研究

采用Sephadex G-10凝胶双柱精制还原型谷胱甘肽(GSH)。研究了脱盐上样体积、分级分离上样浓度及上样体积对GSH洗脱的影响。结果表明,在脱盐上样体积为10 mL、分级分离上样浓度和上样体积分别为10 mg.mL-1和5 mL的优化条件下,所得GSH含量可达92.40%。

凝胶过滤层析一步纯化MC-LR Fab的方法及吸附机制初探

为高效制备高纯微囊藻毒素(MC-LR)Fab片段,采用木瓜蛋白酶酶解腹水中纯化获得的单克隆抗体,利用该Fab片段与凝胶过滤层析介质结合的特殊现象分离酶解混合物。通过单因素实验考察流动相中离子强度和pH对Fab片段在柱中保留行为的影响,结合Fab片段等电点(pI)及聚集性质分析二者结合机制。结果表明,腹水经protein G纯化得到纯度大于90%的IgG,IgG经木瓜蛋白酶酶解,主要产物为Fab片段、Fc片段和少量IgG,酶解混合物经凝胶过滤层析一步纯化获得纯度为94.5%,回收率为51%,对MC-LR抑制率为94%的Fab片段。Fab片段pI为6.02,由于表面较强疏水性产生聚集,疏水吸附导致Fab片段与凝胶过滤层析介质结合,降低流动相中离子强度,减弱疏水作用同时提高pH增强离子排阻作用可使Fab片段消除吸附,实现了Fab片段的高效制备。

一种新型提取SOD的方法——串联凝胶过滤层析法

目的:建立串联凝胶过滤层析法,一步即可从猪血中提取纯酶。方法:猪血中粗酶液的分离采用经典的有机溶剂(乙醇-氯仿)的方法进行。后在室温下用葡聚糖G100-G50进行柱层析,层析液用pH 7.6,0.02 mol/L-1的磷酸盐缓冲液。首次过柱就可生产出一部分纯酶。接着收集不纯的酶液,再进行第2次串联层析,就可把所有的酶液彻底纯化。结果:2次之和的酶液总产率达70%,比活性达4700 u.mg-1。结论:经聚丙烯酰胺凝胶电泳及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别,该产品是高纯度的,并且高产率。

基于响应面法优化凝胶过滤在分离乳铁蛋白中的工艺研究

目前我国乳铁蛋白主要依靠进口,产业化发展相对较慢,相对于其他原料,牛初乳具有廉价、易获得等优点。为低成本获得更多乳铁蛋白,本文对凝胶过滤层析纯化方法进行了优化,并设计了响应曲面试验。研究了磷酸盐缓冲液pH、流速、洗脱液浓度三个不同因素对乳铁蛋白含量的影响,通过设计三因素三水平的响应面试验分析优化凝胶过滤层析在乳铁蛋白纯化中的应用,检测方法采用紫外分光光度法,测量所得样品在475 nm处的OD值,计算出相应的质量浓度,得到最终结果。试验表明:最优工艺条件为磷酸盐缓冲液pH 7.48,流速0.20 mL/min,洗脱液浓度0.42 mol/L,预测乳铁蛋白质量浓度为170.567μg/mL。在此条件下进行三次重复试验并取平均值,实际所得乳铁蛋白质量浓度为166.485μg/mL,相对误差为2.393%,与模型基本吻合。

利用凝胶过滤层析技术分离人源γ-微管环形复合物

目的分离人源γ-微管蛋白环形复合物(γ-tubulin ring complex,γTuRC)。方法利用凝胶过滤层析技术分离人源293FT细胞裂解产物;利用免疫印迹检测γTuRC和γ-微管蛋白小复合物(γ-tubulin small complex,γTuSC)所在的洗脱组分,实现复合物与游离蛋白分离。结果γTuRC复合物组成型组分γ-微管蛋白(γ-tubulin)、γ-微管蛋白复合物蛋白2(γ-tubulin complex protein 2,GCP2)、GCP3和GCP4在第4洗脱组分(4#)被洗脱富集,该组分相对分子质量约为2×106;γTuSC复合物组成型组分γ-tubulin、GCP2、GCP3蛋白在14#洗脱组分被洗脱富集,该组分相对分子质量约为3.1×105;未掺入的游离蛋白组分在18#洗脱组分后被洗脱下来。非变性凝胶电泳可在相应组分中检测到γTuRC和γTuSC复合物。结论γTuRC复合物在凝胶过滤层析4#洗脱组分得到富集;γTuSC复合物在14#洗脱组分得到富集。上述复合物与游离蛋白成功分离,可用于后续复合物组装研究。

一种基于凝胶过滤层析的水疱性口炎病毒(VSV)的纯化方法

本研究目的是开发出一套简单有效的水疱性口炎病毒(VSV)的纯化方法,该方法可为基于VSV的医用治疗平台相应的载体,也可为疫苗及溶瘤剂的研发提供一定的技术支撑和物质储备。选用BHK细胞作为VSV复制的载体,并通过显微镜观察细胞病变(CPE)的出现;应用凝胶过滤层析法对收获且处理过的病毒液进行纯化,包括第1轮饱和硫酸铵沉淀高盐除杂和第2轮以严格的吸收峰洗脱为特色的凝胶过滤层析的进一步纯化。通过SDS-PAGE、Western blot、ELISA、电镜验证等分析纯化产物的纯度和准确性。SDS-PAGE显示本方法明显除去病毒上清中大部分杂质;Western blot、ELISA、电镜证实纯化产物是VSV病毒。经使用Reed-Muench法计算病毒的半数组织细胞感染量(TCID)效价为10,RT-PCR的方法鉴定毒株为印第安纳毒株(Indiana, IN)。上述结果表明,本研究成功研制出一套方便、高效、简易的VSV纯化方法,为VSV的纯化和使用提供了参考依据。

凝胶层析分离纯化乳酸菌菌体蛋白条件的优化

采用凝胶过滤层析分离纯化乳酸菌菌体蛋白,选择不同的凝胶过滤介质、过滤柱高度、洗脱流速、样品上样量对经过Sephadex G-25脱盐处理的乳酸菌菌体蛋白进行洗脱,观察洗脱峰。结果表明,凝胶过滤介质、过滤柱过度、洗脱流速和样品上样量均不同程度的影响菌体蛋白的纯化效果。在本试验中,分离纯化乳酸菌菌体蛋白的凝胶过滤层析参数为:Sephadex G-75的层析介质以45 cm的柱床高度,洗脱流速0.75 m L/min,样品上样量为5%CV时,对乳酸菌菌体蛋白可达到最佳的分离纯化效果。

自然发酵对淀粉凝胶的改性机理及发酵菌株的筛选

采用凝胶过滤层析法研究整粒大米自然发酵后淀粉分子质量分布的变化 ,探讨发酵对淀粉凝胶改性的机理。发现发酵后淀粉大分子降解 ,中等及小分子质量淀粉比例增加 ,分子质量大小趋于均匀 ,从而使淀粉分子易于接近聚合而增强了淀粉凝胶性能。对发酵样品的显微观察发现 ,淀粉粒结构并未破坏 ,因而淀粉溶出损失很小 ,初步认为是微生物所产酶和酸渗入颗粒内部作用的结果。通过对自然发酵菌株的分离筛选获得 3株酵母、5株细菌、2株霉菌。经过工艺试验认为 ,自然发酵主要是酵母菌作用的结果。研究结果可为进一步提高传统发酵类淀粉凝胶食品如馒头、发酵型米粉的品质、改良产品工艺开拓新的途径。

碧根果致敏原Car i 1的分离纯化及表征鉴定

目的分离纯化碧根果致敏原Car i 1,并对其结构进行表征鉴定。方法以新鲜碧根果果仁为原料,通过粉碎、脱脂、浸提、粗分级、凝胶过滤层析,对碧根果致敏原蛋白Car i 1进行分离纯化。结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、液相色谱-串联质谱法和免疫印迹法3种方法对Cari1进行鉴定,并通过圆二色谱仪与紫外分光光度计表征其二、三级结构。结果本方法纯化获得碧根果致敏原Cari1,单轮制备量可达5 mg以上,且纯度大于95%,蛋白质高级结构未被破坏,能够被全部3名碧根果过敏患者的血清准确识别。结论该纯化方法技术路线简单、设备要求低且单次制备量高,总得率可达65%,操作便捷,为碧根果致敏原Car i 1的相关研究奠定了物质基础。

两步串联层析法纯化鼠抗人CD28单克隆抗体2F5

目的建立从小鼠腹水中纯化鼠抗人CD28单克隆抗体(mAb)2F5的两步串联层析法。方法将含mAb2F5的腹水经离心、过滤及缓冲溶液变换预处理后,先经固相化金属螯合亲和层析法(immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)纯化,去除大部分杂蛋白,再经凝胶过滤层析法(gelfiltration,GF)精细纯化,并探讨了上样的流速和洗脱液的种类对mAb2F5纯度的影响。纯化的mAb2F5的生物学活性用3H-TdR掺入法进行分析。结果以两步串联层析法纯化的鼠抗人CD28mAb2F5的纯度大于90%,总回收率达70%。纯化的mAb2F5在体外对PBTC具有明显的促增殖作用;而且其促增殖作用的活性优于ProteinG亲和层析法(affinitychro-matography,AC)纯化所获得mAb。结论建立的两步串联层析纯化方法操作简便,所得mAb的纯度高、生物学活性好。