HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验

目的 表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力。方法 用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20—lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体。将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)_(600nm)达到0.6时,加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力。结果 IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20％以上。表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85％以上目的蛋白。凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变。结论 融合蛋白HA20—lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率。

从非变性聚丙烯酰胺凝胶中快速高效回收DNA片段

获得特异性的DNA是开展多种分子生物学试验的前提,具有高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳是纯化特异性DNA的首选。借助液氮对凝胶的固化作用,介绍了通过研磨破坏聚丙烯酰胺凝胶结构回收纯化DNA的方法。将通过该方法回收纯化的DNA和采用琼脂糖凝胶电泳回收纯化的DNA,经由聚丙烯酰胺凝胶电泳的进一步检测,结果显示,该方法与琼脂糖凝胶电泳回收法相比,所获得DNA的纯度高,特异性好,且效率相当。在提高DNA特异性的同时也兼具了经济高效耗时少等优点,可以广泛应用。

小麦WPBF与高分子量谷蛋白基因上游Prolamin-Like box的特异结合

【目的】克隆普通小麦胚乳特异表达转录因子基因WPBF,对其原核表达条件进行优化,并验证其编码蛋白和小麦高分子量谷蛋白亚基基因(HMW-GS)上游Prolamin-Like box的结合特性,为小麦HMW-GS表达调控机制的阐明奠定基础。【方法】利用RT-PCR扩增得到WPBF编码区,将其连接到pET-21a-MBP载体中,并分别在E.coliT7 Express和Origami B(DE3)菌株中诱导表达。依次利用Amylose和Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,最后通过凝胶迁移阻滞试验(EMSA)对重组蛋白的DNA结合特性进行分析。【结果】在33℃的Origami B(DE3)菌株中表达含MBP和His双标签的重组WPBF大部分以可溶性形式存在,其表达量占细菌总蛋白的48.0%。重组WPBF和含HMW-GS上游Prolamin-Like box的两类DNA探针能发生特异结合,但重组WPBF和含"TGCAAAG"基序DNA探针的结合强度高于其和含"TGCAAG"基序DNA探针的结合。【结论】建立了优化的WPBF原核表达系统,并获得具有生物活性的重组蛋白;重组WPBF能与HMW-GS启动子来源的两种Prolamin-Like box特异性结合,但结合能力存在差异。

马尾松毛虫质多角体病毒NS5蛋白的表达和功能初步分析

马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株第9个片段编码非结构蛋白NS5,利用pET-32a(+)载体带有组氨酸标记的重组蛋白进行表达,获得纯化的重组蛋白。利用凝胶电泳阻滞检测试验(EMSA)检测蛋白和核酸的结合作用,结果表明NS5蛋白能与病毒基因组dsRNA结合。

N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍诱导共表达的蛋白基因启动子区的转录因子结合部位分析

目的 :分析甲基硝基亚硝基胍 (MNNG)诱导的共表达蛋白的编码基因启动子区的转录因子结合部位。方法 :用进化足迹法 ,结合转录因子数据库的搜索 ,预测共表达蛋白编码基因启动子区共有的转录因子结合部位。凝胶阻滞试验验证对于预测出的转录因子结合部位 ,在MNNG处理细胞中是否确实有相关转录因子的反应。结果 :预测出 11个共同存在于这些蛋白编码基因启动子区的转录因子结合部位 ,其中除已知转录因子激活蛋白 1(activatorprotein 1,AP1)在MNNG处理后被激活外 ,用凝胶阻滞试验又发现在MNNG处理细胞的核提取液中有 2个转录因子—核因子Y(nuclearfactor,NFY)和GATA结合因子 (GATAbindingfactor,GATA)的活性升高。结论 :进化足迹法可以有效地降低转录因子结合部位预测结果中的假阳性率。NFY和GATA转录因子结合部位可能参与对MNNG诱导的共表达蛋白的共调控。

甘蔗杆状病毒P2蛋白核酸结合活性分析及关键结构域鉴定

甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform virus,SCBV)是广泛分布于世界甘蔗种植区的严重危害甘蔗种植的植物病毒之一。研究SCBV编码的病毒蛋白功能对于了解该病毒致病机制及抗病育种具有重要意义。本实验室前期从云南勐海的一株Badila甘蔗中分离获得了SCBV的全长基因组序列,并开展了其开放阅读框2(open reading frame 2, ORF2)编码的未知蛋白P2的功能研究。通过原核表达SCBV P2蛋白并经体外核酸亲和结合试验分析,发现SCBV编码的P2蛋白能以序列非特异性方式与同源或异源核酸亲和结合。进一步对P2蛋白中预测的coiled-coil like domain及C-端保守的脯氨酸、赖氨酸富集区域进行缺失及点突变分析,以及凝胶阻滞试验发现,随着C-端逐步截短,P2突变体蛋白与核酸结合的活性也逐渐减弱,其C-端保守的含脯氨酸、赖氨酸的21个氨基酸(amino acids,aa)对P2蛋白与核酸结合是必需的。同时,在P2蛋白与核酸的相互作用中,coiled-coil like domain被证明是不可或缺的。进一步酵母双杂交实验证明P2蛋白能与自身互作,且P2 C-端保守的21个氨基酸及coiled-coil like domain的缺失或替换直接影响了P2蛋白的自身互作。综上所述,本研究发现SCBV编码的P2蛋白是一个序列非特异性的核酸结合蛋白,且coiled-coil like domain和C-端保守的富含脯氨酸、赖氨酸区域通过影响其自身互作而影响其核酸结合活性。研究结果为进一步深入研究P2蛋白功能奠定了基础。

施氏假单胞菌固氮调控蛋白NifA调节电子传递体rnf1基因簇的表达

施氏假单胞菌A1501中电子传递体基因簇rnf1位于固氮基因岛上,该基因簇的突变造成固氮酶活显著下降。在rnf1基因簇的启动子区含有固氮调控蛋白Nif A的保守结合序列,实时定量qRT-PCR分析证实了nif A突变株中rnf1基因簇的表达量与野生型相比急剧下调,暗示着Nif A直接参与rnf1基因簇的表达调控。细菌单杂交系统的体内互作实验表明,在大肠杆菌体内Nif A与rnf1基因簇启动子存在直接相互作用;进一步的凝胶阻滞试验证明原核表达纯化的Nif A蛋白与rnf1基因簇启动子序列存在体外直接结合。上述结果从分子水平上给出了两者间相互作用的直接证据,为深入研究联合固氮基因的表达调控网络奠定了基础。