凝血因子Ⅸ/凝血因子Ⅹ结合蛋白家族的研究进展

凝血因子Ⅸ /Ⅹ结合蛋白家族是近来发现的C型动物凝集素超家族中一个亚家族 .它们存在于蝰科蛇毒中 ,不具有酶活性 ,通过与凝血因子Ⅸ或凝血因子Ⅹ结合来延长凝血时间 .在钙离子存在下结合在凝血因子Ⅸ /Ⅹ分子中γ 羧基谷氨酸区域 .它们彼此之间具有很高的序列同源性 ,都是由两条同源的肽链通过一对二硫键相连 .两条肽链都具有C型糖识别区的二硫键构型 ,各含一个钙离子结合位点 .其中habu凝血因子Ⅸ /Ⅹ结合蛋白的晶体结构已经测定 ,除掉相互交叠的中心环外 。

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(humanclottingfactorIX ,hFIX)的可行性 ,构建了包括山羊 β 酪蛋白基因启动子和外显子 1、内含子 1、外显子 2共约 6 .7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子 1的乳腺表达载体 ,通过转基因技术获得 12个原代转基因小鼠 (9♀ ,3♂ ) ,整合率为 11.2 %。经ELISA和Westernblot鉴定 8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性 ,其中一只的表达量高达5 2 .9mg/L ,其凝血活性亦高达 2 79.2 %。FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上。结果证明所构建的山羊 β 酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达 ,并能保持hFIX的生物活性。

镁钙离子诱导的人凝血因子Ⅸ、蛋白C的构象变化及其与相应特异单抗的连接状态

用圆二色光谱、荧光光谱及紫外差光谱研究镁钙离子诱导的ＦⅨ、ＰＣ的构象变化并通过蛋白负染电镜及荧光偏振实验观察了各构象与ＦⅨ、ＰＣ特异单抗的连接状况。ＦⅨ、ＰＣ在镁钙离子诱导下，其３种光谱均发生显著变化，并且与缓冲液中的金属离子浓度有关。ＦⅨ、ＰＣ的特异单抗仅与ＦⅨ、ＰＣ的某种特定构象发生连接反应。

钙（Ⅱ）对抗凝血因子Ⅱ与活化凝血因子X结合反应的影响

皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅱ（ACFⅡ）不具有酶的活性，通过与活化凝血因子X（FXa）的合成1：1复合物来延长凝血时间。用高效液相色谱方法，发现ACFⅡ与FXa的结合反应依赖于Ca（Ⅱ）浓度，ACFⅡ与FXa的最大结合反应所需要的Ca(Ⅱ)浓度约为1×10^-3mol/L，平衡透析的结果表明，ACFⅡ分子中有两个不同亲和性的Ca（Ⅱ）结合位点，表观结合常数分别为（1．1±0．3）×10^5L/mol和（1．7±0．4）×10^4L/mol,ACFⅡ与2个Ca(Ⅱ）结合所需要的Ca(Ⅱ)浓度也约为1×10^-3mol/L,Ca(Ⅱ)对ACFⅡ的荧光有增强效应，其最大荧光增强所需要的Ca(Ⅱ)浓度也约为1×10^-3mol/L。由此推测ACFⅡ结合上2个Ca(Ⅱ)可能是其与FXa结合的前提条件。

肾病综合征患儿血浆纤维蛋白原凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ的改变

为探讨肾病综合征高凝状态的发生机理 ,检测了 40例肾病综合征患儿血浆纤维蛋白原 ,凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ。发现纤维蛋白原的含量和凝血因子Ⅷ的活性均显著增高 ,Ⅻ因子活性明显降低 ,而Ⅺ因子活性无明显改变。提示肾病综合征患儿凝血因子的代谢是复杂的 ,凝血因子代谢紊乱是肾病综合征患儿血浆高凝状态发生的一个重要原因。

人凝血因子Ⅸ-R338A高活性突变体在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)在人类内源性凝血过程中起着非常重要的作用。hFⅨ表达量绝对或相对不足会导致B型血友病。本研究用毕赤酵母生产重组高活性突变体hFⅨ-R338A。方法首先构建pPICZaA-hFⅨ-R338A酵母分泌表达载体,其次将其用电转化入毕赤酵母SMD1168中,再次利用G418抗药性的能力筛选表达量高的单克隆重组菌株,培养并将表达产物纯化,稀释后检测其凝血活性。结果通本研究获得的重组SMD1168-hFⅨ-R338A表达量达到(90-120)mg/L;比活力约为人血中野生型hFⅨ凝血活性的(38.93±5.1)%,比野生型的酵母重组hFⅨ高6.85倍。结论人凝血因子Ⅸ高活性突变体R338A是潜在的天然凝血因子替代品。

肝素与抗凝血酶Ⅲ对人凝血因子Ⅸ效价检测的影响

目的了解不同浓度水平的肝素、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)或肝素/ATⅢ(1∶1混)对人凝血因子Ⅸ(FⅨ)类制品中FⅨ效价检测的影响。方法向FⅨ或人凝血酶原复合物(PCC)样品中加入不同浓度水平的肝素或肝素/ATⅢ来制备每1 IU FⅨ含0、0.1、0.3、0.5、0.8、1、2、4 IU的肝素或肝素/ATⅢ的样品以及向FⅨ或PCC样品中单独加入ATⅢ时制备每1 IU FⅨ中含0、0.1、0.5、1 IU ATⅢ的样品后,采用一期凝固法测定所制备样品中的FⅨ效价;取适量制备的含不同肝素浓度的样品,分别加入相应量的硫酸鱼精蛋白中和样品中的肝素后再次测定FⅨ效价。观察并分析不同浓度水平肝素、ATⅢ或肝素/ATⅢ对FⅨ效价检测的影响。结果当样品中每1 IU FⅨ的肝素或肝素/ATⅢ含量为0、0.1、0.3、0.5 IU时,FⅨ效价检测结果较一致;当肝素或肝素/ATⅢ含量为0.8、1、2、4 IU时,FⅨ效价检测结果均低于不含肝素样品的检测结果;ATⅢ含量为0、0.1、0.5、1 IU时,样品中FⅨ效价检测一致。结论当FⅨ或PCC制品中每1 IU FⅨ含肝素或肝素/ATⅢ的量≤0.5 IU时,对FⅨ效价的检测结果无影响,可省略加入硫酸鱼精蛋白中和肝素的步骤;>0.5 IU时,宜加入硫酸鱼精蛋白中和肝素后再检测FⅨ效价。

FDA批准重组凝血因子Ⅸ治疗血友病B

重组凝血因子Ⅸ（Alprolix）为Fc融合蛋白，用于成人或儿童血友病B（因子Ⅸ缺乏）患者，可暂时替代失去的凝血因子Ⅸ，达到止血效果。该药含人类IgG。的Fc区段。故可与Fc受体结合，反复进入循环．延迟免疫球蛋白的溶酶体衰解，从而延长其血浆半衰期。主要在围手术期和常规预防中使用，预防和减少出血事件。

凝血因子Ⅸ在CHO细胞中的表达和鉴定

人类B型血友病，是一种由于不能合成正常凝血因子Ⅸ（hVⅨ）所引起的遗传性疾病。补充hFⅨ是控制此种疾病最有效的方法。本文用CHO细胞作为表达系统，pcDNA3．1作为表达载体表达hFIX。经过对细胞进行免疫组化和免疫荧光分析，证明构建的细胞株表达了重组hFIX蛋白。

腹腔镜根治性切除术治疗膀胱癌及对血清胰岛素样生长因子及其结合蛋白-3的影响

目的研究腹腔镜根治性切除术(LRC)治疗膀胱癌(BC)及对血清胰岛素样生长因子-1(IGF-Ⅰ)及其结合蛋白-3(IGFBP-3)的影响。方法纳入2014年1月至2018年12月于武汉市汉口医院接受治疗的BC病人116例,依据随机数字表法分为LRC组(n=58)与开放根治性切除术(ORC)组(n=58)。ORC组行ORC,LRC组行LRC。观察两组术中出血量、手术时间、术后疼痛评分、肛门排气时间、住院时间等围术期指标,术前及术后3 d血清γ-干扰素、白细胞介素-6等炎性因子,血清IGFBP-3、IGF-Ⅰ等肿瘤因子。术后并发症等。结果LRC组术中出血量、术后疼痛评分、肛门排气时间、住院时间等指标均小于ORC组[(448.97±46.65)mL比(747.68±77.39)mL、(5.15±0.54)分比(7.46±0.76)分、(3.68±0.38)d比(4.48±0.47)d、(17.67±1.92)d比(21.86±2.22)d],手术时间大于ORC组[(318.96±33.44)min比(276.84±29.85)min](P<0.05)。术后3 d,LRC组IL-6水平均低于ORC组[(123.86±13.79)ng/L比(130.86±14.93)ng/L],IFN-γ水平高于ORC组[(15.84±1.75)ng/L比(14.96±1.52)ng/L](P<0.05)。术后3 d,两组IGFBP-3、IGF-Ⅰ水平均差异无统计学意义[(179.75±19.57)mg/L比(182.61±19.62)mg/L、(2.74±0.29)μg/L比(2.70±0.28)μg/L](P>0.05)。LRC组术后并发症发生率(3.45%)低于ORC组(13.79%)(P>0.05)。结论LRC可有效切除BC病灶,改善IGFBP-3、IGF-Ⅰ水平,对机体凝血功能影响小,术后炎症反应轻,疗效与ORC一致,且创伤小,术后并发症发生率低,术后恢复快。

高纯度凝血因子Ⅸ制剂的制备方法

人凝血因子Ⅸ（FⅨ）为参与人体凝血过程中不可或缺的维生素K依赖型糖蛋白,相对分子质量大小约57 k Da,在体内由肝细胞合成并分泌到血液中。血浆中人凝血因子Ⅸ的浓度很低,健康成年人为5μg/m L左右。当血浆中人凝血因子Ⅸ含量或活性大幅下降时,内源性凝血途径受到阻碍,人体无法进行正常的凝血,从而引发B型血友病。

人凝血因子Ⅸ-V107A-R338A高活性突变体在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)在人类内源性凝血过程中起着非常重要的作用。hFⅨ表达量绝对或相对不足会导致B型血友病。本研究用毕赤酵母生产重组高活性突变体hFⅨ-V107A-R338A。方法首先构建pPICZaA-hFⅨ-V107A-R338A酵母分泌表达载体,其次将其用电转化入毕赤酵母SMD1168中,再次利用G418抗药性的能力筛选表达量高的单克隆重组菌株,培养并将表达产物纯化,稀释后检测其凝血活性。结果通过本研究获得的重组SMD1168-hFⅨ-V107A-R338A表达量达到80-120mg/L;活力约为人血中野生型hFⅨ凝血活性的(44.06±2.3)%,比野生型的酵母重组hFⅨ高7.75倍,比单突变R338A高13.17%。结论人凝血因子Ⅸ高活性突变体V107A-R338A是潜在的天然凝血因子替代品。

RNAi介导的Bip表达下调促进基于蛋白质剪接的双链共转基因细胞分泌FⅤⅢ凝血活性

目的探讨用RNA干扰技术下调内质网蛋白伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的表达,对基于蛋白质剪接的双链共转凝血因子ⅤⅢ(FⅤⅢ)基因HEK293细胞分泌剪接FⅤⅢ蛋白的量和活性的影响。方法以培养的HEK293细胞,用含蛋白内含子的B区缺失型FⅤⅢ(BDD-FⅤⅢ)的重链和轻链基因表达载体共转染经Bip-siRNA处理的细胞,免疫印迹法检测Bip的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长,用酶联免疫吸附(ELISA)和发色分析法分析转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ蛋白量和活性。结果 RNA干扰下调Bip表达作用明显,细胞生长不受影响;Bip下调的共转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ和重链量分别为(142±33)μg/L和(197±43)μg/L,明显高于对照细胞[分别为(89±23)μg/L和(120±27)μg/L];Bip下调的共转基因细胞分泌的FⅤⅢ凝血活性为(1 050±160)IU/L,明显高于对照细胞[640±170(IU/L)]。结论 Bip表达下调通过促进剪接BDD-FⅤⅢ的分泌可有效提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅤⅢ基因功效,为进一步动物体内实验提供了依据。

钙(Ⅱ)对尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅰ的抗凝血活性的影响

皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子I（ACF I）不具有酶的活性，通过与活化凝血因子X（FXa）结合成1：1的复合物来延长凝血时间。用高效液相色谱分析方法，发现 ACF I与FXa的结合反应依赖于 Ca2+浓度，ACF I与 FXa的最大结合反应所需要的 Ca2+浓度为 1mol· L-1 。稀土和过渡金属离子对ACF I的荧光有淬灭作用，相反， Ca2+对 ACF I的荧光有增强效应。 Ca2+对维持 ACF I的特定构象起着重要作用。 Ca2+诱导的 ACF I构象变化可能是ACF I与 FXa结合的必要条件。

遗传性凝血因子缺陷症和抗凝血因子缺陷症研究

遗传性凝血因子缺陷症,包括低(无)纤维蛋白原血症、凝血酶原、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ(血友病A)、凝血因子Ⅸ(血友病B)、血管性血友病(vWD)、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅺ、凝血因子ⅩⅢ等缺陷症,它们引起遗传性出血病;遗传性抗凝血因子缺陷症,主要包括抗凝血酶(AT)、蛋白C(PC)和蛋白S(PS)等缺陷症,它们引起遗传性血栓病.罹患这些疾病的患者,不仅自幼发病、持续终生,而且还遗传给后代.研究这些疾病,是为了减少病人的痛苦、致残和死亡,减轻家庭、社会和国家的负担;阻止疾病的遗传和有病胎儿的出生,优生优育和提高民族健康水平;为从根本上解决遗传病的基因治疗奠定理论和实践基础.

冷沉淀凝血因子外用及静脉输注联合治疗深二度烧伤创面的效果观察

冷沉淀凝血因子是将新鲜冰冻血浆置于（4±2）℃水浴装置中融化，当血浆基本融化时离心，将大部分上层血浆移至空袋，制成冰冻血浆，留下的20～30mL血浆与沉淀物混合制备而成的。冷沉淀凝血因子中包括因子Ⅷ、血管性血友病因子、纤维结合蛋白（Fn）等成分。凝血因子和纤维蛋白原具有明显的止血作用，同时可促进上皮细胞生长，在细胞上皮化过程中起“支架”作用，是促进创伤愈合的重物质。

组织因子凝血途径抑制物

近年来国外对组织因子凝血途径抑制物(Tissue factor pathway inhibitor,TFPI)研究报道较多。已成为一个热点。本文拟就其性质、作用机理、应用等做一综述。 1 TFPI的性质 早年在1947年Thomas和Schneide就各自独立报道了在对TF诱导DIC动物模型中。

国产冻干人凝血酶原复合物质量标准的研究

目的通过对国产人凝血酶原复合物 (PCC)质量的研究 ,建立与国际接规的质量标准。方法用人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ (FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ )浓制剂国家标准品 ,采用一期法测定国内用不同原料制备的PCC中FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ的效价 ;用正常人血浆作标准 ,用凝固法检测PCC的总效价及PCC中的肝素。结果用血浆作原料提纯制备的PCC ,FⅣ的效价能达到 1 0IU/ml以上 ,FⅦ效价最低 ;用组分Ⅲ作原料 ,FⅣ活性损失很大 ,只有 2 / 7批次能达到 1 0IU/ml;而FⅦ效价最高。无论用何种原料 ,FⅡ和FⅩ活性均能保持在一定水平。结论从血浆中直接提纯制备PCC ,能有效地保持FⅣ活性 。

纤维蛋白原结构与血栓形成

纤维蛋白原(简称纤原)是最早发现的人体内与凝血有关的重要因子。在血栓形成过程中它在凝血酶作用下先转化为纤维蛋白单体,然后相互以非共价键形式聚合起来,并在第ⅩⅢ凝血因子的作用下交联,成为血栓的基质骨架。对纤原的结构和功能的研究不仅有助于了解它在血栓形成过程的作用,更重要的是可为血栓性疾病的防治提供理论依据。