凝血因子Ⅹa抑制剂专利技术分析

抗凝血药物被广泛用于血栓栓塞性疾病的预防和治疗。近年来,凝血因子Ⅹa抑制剂成为新型抗凝血药物的研发热点,但目前上市的抗凝药物仍存在长期使用会增加出血风险等不良反应。本文通过文献检索,对凝血因子Ⅹa抑制剂相关专利申请状况进行了分析,以百时美施贵宝公司和广东东阳光药业有限公司作为该领域重点企业代表,对其专利申请发展路线进行梳理,总结凝血因子Ⅹa抑制剂化合物的改造位点和研发方向,以期能够为国内研发机构和相关企业对凝血因子Ⅹa的新药研发、专利保护以及知识产权布局提供有益的参考和建议。

重组人凝血因子Ⅷ对凝血因子Ⅹa生成及血友病小鼠凝血功能的影响

目的探究在研重组人凝血因子Ⅷ(recombinant human coagulation factorⅧ,rhFⅧ)对凝血因子Ⅹa(coagulation factorⅩa,FⅩa)生成的促进效果,并与已上市同类产品进行比较;进一步开展rhFⅧ对小鼠模型凝血功能影响的研究。方法分别在固定FⅧ、FⅩ、FⅨa中任意2个因子、改变第3个因子浓度时,通过体外实验检测FⅩa活性,测定在研rhFⅧ和市售FⅧ产品的FⅩa生成速率并比较。A型血友病模型小鼠(HA小鼠)尾静脉单次静脉注射在研rhFⅧ或市售rhFⅧ产品后,检测小鼠凝血相关指标的变化。结果体外实验中,与市售rhFⅧ产品ADVATE、血源性人FⅧ相比,在研rhFⅧ在不同条件下均具有相似或更高的FⅩa生成速率。注射在研rhFⅧ后HA小鼠活化部分凝血活酶时间缩短(50和100 IU/kg剂量下分别为29.43和20.78 s),具有剂量依赖性,同剂量下与市售rhFⅧ产品Xyntha一致。结论在研rhFⅧ与市售rhFⅧ和血源性人FⅧ相比,在体外具有相同的促FⅩa生成活性,且在HA小鼠模型中促凝血效果得到了验证,具备成药性的潜质。

热敏灸预处理对膝关节镜手术患者炎性疼痛及血浆凝血因子Ⅹ活性的影响

目的:研究膝关节镜手术患者在麻醉前接受热敏灸预处理的临床效果。方法:选择2021年7月—2023年2月在江西中医药大学附属医院接受膝关节镜手术治疗的患者120例,用随机数字表法将其分成对照组和研究组。对照组(n=60)术前实施腰硬联合麻醉,研究组(n=60)于术前3 d开始实施热敏灸预处理。对比两组疼痛情况、凝血因子Ⅹ活性、IL-6水平及血液流变学相关指标。结果:术前72 h、术后72 h,两组视觉模拟评分法(VAS)评分比较,差异均无统计学意义(P>0.05);术后6、24、48 h,研究组VAS评分均低于对照组(P<0.05)。术后24、72 h,研究组IL-6水平均低于对照组(P<0.05)。术后24 h,研究组凝血因子Ⅹ活性低于对照组(P<0.05);术后72 h,两组凝血因子Ⅹ活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。术后24、72 h,研究组血浆黏度和全血黏度均低于对照组(P<0.05)。结论:膝关节镜手术患者在麻醉前,接受热敏灸预处理,可降低患者围手术期疼痛感,改善凝血功能,预防血栓形成,可作为膝关节镜手术患者炎性疼痛及血浆凝血因子Ⅹ活性改善的主要治疗方案。

急性发热性嗜中性皮病伴凝血因子Ⅹ缺乏症1例并文献复习

急性发热性嗜中性皮病又称Sweet综合征,是一种少见的炎症性疾病,临床表现包括发热、白细胞计数升高、皮肤红斑性病变(丘疹、结节和斑块)和弥漫性浸润,其发病机制尚不清楚,可能与血液系统等恶性肿瘤、系统性红斑狼疮、干燥综合征,以及呼吸道、消化道感染、妊娠等及药物相关[1-4]。同时,凝血因子Ⅹ缺乏症较少见,且因子活性与出血风险相关。在临床上以Sweet综合征为首发疾病伴凝血因子Ⅹ缺乏症罕见,其诊断有一定难度。

尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅱ与活化凝血因子Ⅹ的结合性质

皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅱ (ACFⅡ )与活化凝血因子Ⅹ (FⅩa)在钙离子作用下形成了 1∶1的复合物 ,从而延长凝血时间 .这个复合反应是依赖于钙离子的 ,ACFⅡ在没有钙离子存在条件下不能与FⅩa形成复合物 .ACFⅡ是凝血因子Ⅸ或凝血因子Ⅹ结合蛋白家族中一个新发现的成员 ,其相对分子质量为 2 946 8 1.ACFⅡ分子中含有 2 5 1个氨基酸残基 ,其氨基酸组成与这一家族中其他成员十分相似 .ACFⅡ在抗凝血反应中存在一临界浓度 (12nmol/L) ,只有在高于其临界浓度时 。

慢性重型肝炎凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的动态变化及临床意义

探讨慢性重型肝炎患者血清中凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ水平的动态变化及临床意义。方法:78例慢性重型肝炎患者分为死亡组和存活组,前者分为早期、中期、晚期,后者分为早期、恢复期,采用血凝法动态检测两组各期及对照组中患者凝血因子Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ的水平,并比较它们之间的差异。结果:慢性重型肝炎患者死亡组早期凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ水平分别为34.64±2.89、20.96±2.23、42.62±3.28,中期分别为22.81±2.28、14.40±1.63、32.67±2.70,晚期分别为14.25±1.76、9.90±1.48、25.76±2.44,均显著低于正常对照组,且随肝功能受损程度加剧而呈进行性降低,其中19因子下降最明显。存活组早期3种因子水平分别为45.58±8.69、21.96±6.61、42.27±12.25,均显著低地正常对照组。恢复期中Ⅶ因子为68.85±31.74,Ⅹ因子为64.12±11.65,仍低于正常对照组(P<0.05),但Ⅴ因子与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。在存活组与死亡组的早期Ⅴ因子的活性有显著性差异(t=2.44,P<0.05),而Ⅶ因子、Ⅹ因子差异无显著性(t值分别为0.38、0.09,P>0.05)。结论:动态观察凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ水平的变化,对慢性重型肝炎的早期诊断和判断预后有一定价值。Ⅶ因子是较灵敏的指标,Ⅴ因子是判断预后的最好指标,由于凝血酶原时间(PT)和凝血酶原活动度(PTA)

首批人凝血因子Ⅱ和Ⅹ浓制剂国家标准品协作标定

目的协作标定首批人凝血因子Ⅱ和Ⅹ浓制剂国家标准品。方法用世界卫生组织 98 590批人凝血因子Ⅱ和Ⅹ浓制剂国际标准品 ,采用一期法标定我国首批人凝血因子Ⅱ和Ⅹ浓制剂国家标准品 ,将标准品分别于4℃、2 2℃、37℃保存 5个月 ,进行稳定性考查。结果人凝血因子Ⅱ和Ⅹ国家标准品的效价分别为 1 6 .1IU 支和 1 2 .1IU 支 ,稳定性良好。

2种F10基因新突变导致凝血因子Ⅹ缺陷症的分子发病机制研究

目的:探讨1个凝血因子Ⅹ(FⅩ)缺陷症家系的分子发病机制。方法:对先证者及家系成员凝血、抗凝及纤溶功能筛查以及凝血因子活性及抗原含量检测进行表型诊断;以Western Blotting检测血浆中FⅩ抗原含量和分子量大小;以中和试验检测FⅩ的抑制物。以PCR方法对F10基因所有外显子及侧翼序列和5’端非翻译区进行扩增,产物纯化后直接测序进行基因诊断;构建F10基因突变表达质粒,瞬时转染HEK293T细胞,测定表达产物的FⅩ促凝活性(FⅩ:C)和FⅩ抗原含量(FⅩ:Ag)。结果:先证者FⅩ:C和FⅩ:Ag分别为<1%和53.36%,中和试验结果阴性,诊断为交叉反应物质阳性(CRM+)的FⅩ缺陷症。F10基因分析发现2个杂合突变:IVS5+1G>A和Asp368del。Asp368del体外表达显示FⅩ:C和FⅩ:Ag分别为(0.52±0.04)%和(85.9±5.0)%,为CRM+突变。结论:F10基因双重杂合突变IVS5+1G>A和Asp368del导致该家系遗传性FⅩ缺陷症。剪接位点突变IVS5+1G>A导致内含子无法正常剪接,影响FⅩ正常表达。Asp368del突变蛋白能够正常表达,但功能降低。

凝血因子Ⅹ研究进展

凝血因子Ⅹ (FⅩ )处于内源性凝血途径和外源性凝血途径的共同通路 ,在凝血过程中发挥着关键作用。近年来 ,通过对遗传性凝血因子Ⅹ缺陷症的FⅩ基因突变的研究 ,对FⅩ的结构与功能的关系有了深入理解。

蝰蛇(缅甸亚种)毒凝血因子Ⅹ激活物FⅤe-1的分离纯化与理化活性的研究(英文)

【目的】从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离纯化一种凝血活性因子Ⅹ激活物FⅤe-1,并研究其理化性质、序列测定以及凝血活性。【方法】应用阳离子交换层析、分子凝胶过滤层析分离纯化蛇毒,采用MALDI质谱测定法测定分子质量,等电聚焦电泳测定等电点,Edman降解法测定蛋白N末端氨基酸序列,发色底物法和SDS-PAGE等方法测定FⅤe-1的酶学特征和凝血活性。【结果】从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离得到的FⅤe-1为单体蛋白,相对分子质量为13 808,等电点4.6,0.5 mg FⅤe-1的凝血活性与1.5625 u的凝血酶或与54.93 ng RVVⅩ的凝血活性相当;可激活FⅩ,但对凝血酶和纤维蛋白原无作用;酶活性的适宜pH为6.5～7.5,适宜温度为25～60℃;为钙依赖性,凝血活性可被EDTA和DTT抑制;FⅤe-1的N端序列为NH2-N-L-Y-Q-F-G-E-M-I-N;具有呈剂量依赖性的促血浆凝固作用。【结论】从蝰蛇(缅甸亚种)毒纯化出一种FⅤe-1是一个凝血因子Ⅹ的激活物,可激活凝血因子Ⅹ,但对凝血酶和纤维蛋白原的作用微弱。

凝血因子Ⅸ/凝血因子Ⅹ结合蛋白家族的研究进展

凝血因子Ⅸ /Ⅹ结合蛋白家族是近来发现的C型动物凝集素超家族中一个亚家族 .它们存在于蝰科蛇毒中 ,不具有酶活性 ,通过与凝血因子Ⅸ或凝血因子Ⅹ结合来延长凝血时间 .在钙离子存在下结合在凝血因子Ⅸ /Ⅹ分子中γ 羧基谷氨酸区域 .它们彼此之间具有很高的序列同源性 ,都是由两条同源的肽链通过一对二硫键相连 .两条肽链都具有C型糖识别区的二硫键构型 ,各含一个钙离子结合位点 .其中habu凝血因子Ⅸ /Ⅹ结合蛋白的晶体结构已经测定 ,除掉相互交叠的中心环外 。

6个遗传性凝血因子Ⅹ缺陷症家系的表型与基因型诊断

目的:探讨6个遗传性凝血因子Ⅹ(factor Ⅹ, FⅩ)缺陷症家系的分子发病机制,并采用凝血酶生成试验(thrombin generation test, TGT)评估FⅩ缺陷症患者的出血风险。方法:收集6例先证者及相关家系成员的临床资料,凝固法检测内源性、外源性以及共同途径激活的FⅩ活性(FⅩ∶C),酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测FⅩ抗原(FⅩ∶Ag),采用蛋白印迹法检测血浆中的FⅩ相对分子质量及含量,直接测序法检测FⅩ基因(F10)突变,采用TGT检测6例先证者及部分家系成员血浆中的凝血酶生成。结果:在6例先证者中共发现了10种F10突变,其中5种(p.Cys246Ser, p.Tyr319Cys, p.Leu252Phe, p.Arg313Gln以及IVS5-2A>G)为新突变,其余5种(p.Phe71Ser, p.Val338Met, p.Gly406Ser, p.Gly365Ser, p.Cys151Arg)为已报道突变。TGT显示凝血酶生成潜力(endogenous thrombin potential, ETP)及峰值这2个参数与FⅩ缺陷症患者临床出血表现的严重程度具有一定关联。结论 :共发现5种F10基因新突变;5例遗传性FⅩ缺陷症患者由F10双杂合突变所致,1例由F10单杂合突变所致;在浓度为1 pM(1 pmol/L)组织因子(tissue factor,TF)激活下的TGT中,测得的ETP及峰值这2个参数可用于评估FⅩ缺陷症患者的出血倾向,对于了解该病患者的临床出血风险有一定的参考价值。

大剂量静注蛇毒血凝酶注射液致深静脉血栓1例

目的提示临床重视大剂量静注蛇毒血凝酶注射液致深静脉血栓。方法回顾性分析1例结肠息肉术后大剂量静注蛇毒血凝酶注射液致深静脉血栓的病例,记录其年龄、性别、诊断、既往史、给药方法、静脉血栓形成不良反应的过程、形式及处理措施,并分析发生因素。结果患者术后静脉注射蛇毒血凝酶注射液1U预防术后出血,8h给药1次,用药3d。患者静脉血管由发青、发硬、疼痛等症状发展至血管变细、对热不敏感等,最终导致上、下肢深静脉血栓形成。结论血栓性病史患者术后大剂量静注蛇毒血凝酶注射液可致深静脉血栓,临床应用时应严格把握适应证并注意给药途径和剂量。

国产冻干人凝血酶原复合物质量标准的研究

目的通过对国产人凝血酶原复合物 (PCC)质量的研究 ,建立与国际接规的质量标准。方法用人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ (FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ )浓制剂国家标准品 ,采用一期法测定国内用不同原料制备的PCC中FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ的效价 ;用正常人血浆作标准 ,用凝固法检测PCC的总效价及PCC中的肝素。结果用血浆作原料提纯制备的PCC ,FⅣ的效价能达到 1 0IU/ml以上 ,FⅦ效价最低 ;用组分Ⅲ作原料 ,FⅣ活性损失很大 ,只有 2 / 7批次能达到 1 0IU/ml;而FⅦ效价最高。无论用何种原料 ,FⅡ和FⅩ活性均能保持在一定水平。结论从血浆中直接提纯制备PCC ,能有效地保持FⅣ活性 。

注射用血凝酶及其止血作用机制

注射用血凝酶（hemocoagulase atrox for injection）是含有自巴西矛头蝮蛇（bothrops atrox）蛇毒的组分血凝酶和磷脂依赖性凝血因子Ⅹ激活物（简称Ⅹ因子激活物FⅩa）的蛇毒制剂,其起主要作用的是可广泛用于需减少流血或止血的各种医疗情况,如临床各科室的出血和出血性疾病;也可用来预防出血,如手术前用药,可避免或减少手术部位及手术后出血[1]。为了合理使用注射用血凝酶,现将与血凝酶、磷脂依赖性凝血因子Ⅹ激活物和血液凝固等有关的基本慨念和基础理论知识简述如下。

一个遗传性凝血因子Ⅹ缺陷症家系的临床特征与基因突变分析

目的探讨一个遗传性凝血因子Ⅹ(FⅩ)缺陷症家系的临床特征与基因突变关系。方法调查家系,采用Sanger测序法分析先证者F10基因8个外显子及其侧翼序列,并对家系成员相同突变位点进行检测。通过凝血酶生成试验评估家系成员FⅩ的促凝活性。ClustalX-2.1-win和在线生物信息学软件(PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster)分别用于分析突变位点氨基酸的保守性和致病性;Swiss-PdbViewer软件用于蛋白质空间结构和突变氨基酸相互作用分析。结果先证者FⅩ活性(FⅩ:C)和FⅩ抗原(FⅩ:Ag)分别降低至7%和14%(参考范围分别为:90%~114%和90%~110%);先证者平素无自发性出血现象,外伤后也无明显出血异常。基因测序发现先证者F10基因第4号外显子存在c.361T>C(p.Cys121Arg)杂合错义突变及第8号外显子存在c.979C>T(p.Arg327Trp)杂合错义突变;其母亲和女儿为p.Arg327Trp的杂合子,二姐和儿子为p.Cys121Arg的杂合子。先证者凝血酶生成潜力比值和峰高比值下降,而其延迟时间和达峰时间延长。保守性分析显示,p.Arg327和p.Cys121位点在同源物种间均高度保守。生物信息学软件预测两种突变均为致病突变。突变蛋白模型分析显示,p.Arg327Trp突变后,导致蛋白质空间结构和稳定性发生改变。结论该先证者F10基因p.Arg327Trp和p.Cys121Arg复合杂合突变与其FⅩ水平减低有关;该复合杂合突变与临床出血症状相关性不明显。

浅析抗凝药的临床应用

抗凝药可起到抑制血液凝聚的效果,临床常用于预防及治疗血栓栓塞性疾病,分为口服及注射两种方式,华法林及低分子肝素作为传统的抗凝药物,可干扰凝血机制中的多个靶点,抑制血栓的形成与发展,其效率显著。然而其也存在较多弊端,进而影响医患双方使用此类药物的积极性。随着临床研究的不断深入,新型抗凝药物在临床得到推广及利用,如凝血酶抑制剂及凝血因子Ⅹa 抑制剂,其具有起效快其代谢迅速等优点,且并发症少,广泛用于各种心脑血管疾病的预防及治疗中。明确新型抗凝药物的适应证及剂量使用范围,根据个体需要选择适宜药物,使得该种药物发挥其最大作用,为患者提供更多选择,以获得理想的治疗效果。本文对抗凝药物的临床应用情况进行系统综述,望为临床规范使用此类药物提供借鉴与指导。

中低强度华法林抗凝的肺血栓栓塞症患者的国际标准化比值与凝血因子Ⅱ和Ⅹ活性的关系

目的研究肺血栓栓塞症患者口服华法林在中低强度抗凝时国际标准化比值(INR)和凝血因子Ⅱ与Ⅹ活性水平的相关性。方法51例肺血栓栓塞症规律口服华法林抗凝治疗患者,根据其监测的INR指标分为低强度抗凝组(INR 1.6~2.0)和标准强度抗凝组(INR 2.0~3.0)。测定凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ活性水平,分析INR水平和凝血因子活性的相关性。结果低强度抗凝组和标准强度抗凝组INR分别为1.69±0.28和2.55±0.46,对应的凝血因子Ⅱ活性分别为(48.3±28.0)%和(24.0±8.0)%,凝血因子Ⅹ活性分别为(32.8±24.0)%和(16.7±6.0)%。INR和凝血因子Ⅱ和Ⅹ的活性成呈负相关,相关系数分别为–0.903和–0.459。将凝血因子Ⅱ活性<40%,凝血因子Ⅹ活性抑制水平<25%定义为抗凝有效,凝血因子Ⅱ活性水平达到抗凝治疗效果时其所对应的最小INR值为1.56,凝血因子Ⅹ为1.66。结论INR同其凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ活性负相关。随着INR的增高,凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ活性降低,低强度抗凝无法有效抑制凝血因子活性。