人凝血因子7a核酸适配体的筛选与鉴定

人凝血因子7a(FVIIa)是外源性凝血途径的核心因子,检测参与凝血过程的FVIIa及针对FVIIa开发安全有效和经济的凝血剂和抗凝血剂是具有重要的意义。本研究基于指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),采用酸纤维素膜法,通过11轮筛选成功分离出FVIIa的DNA适配体,并模拟了其二级结构。此适配体与FVIIa蛋白结合的表观解离常数为102nmol/L。同时,基于所获得的高亲和力适配体,建立了基于适配体的荧光检测方法。本方法简单高效,对FVIIa蛋白的定量检测范围达到30~80nmol/L,为人凝血因子7a的检测提供了一条新途径。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和适配体的荧光检测方法结果表明,此适配体具有良好的选择性。

丹参素抗血小板凝聚作用的靶点研究

目的探讨丹参素(Danshensu,DSS)抗血小板聚集的分子作用机理及其可能的作用靶点,为丹参素及含有丹参素的中药在临床心脑血管疾病的防治提供科学依据。方法用凝血酶(thrombin)诱导血小板聚集,用血小板聚集仪检测丹参素对血小板聚集率的影响;采用免疫共沉淀的方法,研究丹参素对血小板蛋白质二硫键异构酶ERp57和整合素αⅡbβ3的相互作用;用反向分子对接服务器PharmMapper预测丹参素抗血小板聚集的相关作用靶点;用MOE-Dock的方法,对反向对接的结果进行验证。结果 10μmol·L^(-1)和100μmol·L^(-1)丹参素显著抑制凝血酶诱导的血小板聚集,并呈时间剂量依赖关系(P<0.05)。丹参素抑制血小板ERp57和αⅡbβ3蛋白质的相互作用,凝血因子7(Coagulation factor Ⅶ)可能是其作用靶点之一。结论丹参素具有抗凝血酶诱导血小板聚集的作用,其作用机制与调控血小板ERp57和αⅡbβ3蛋白质的相互作用,以及凝血因子7有关。

TF/FⅦa体外诱导大肠癌LOVO细胞系表达MMP-7mRNA的研究

目的观察组织因子/活性凝血七因子(TF/FⅦa)诱导大肠癌 LOVO 细胞系表达基质金属蛋白酶7(MMP-7)mRNA 及信号传导途径。方法构建靶向组织因子基因干扰的 RNAi 质粒并稳定转染 LOVO 细胞获得 TFRNAi LOVO 细胞系,Western blot 检测干扰效率;RT-PCR 观察100 nmol/L FⅦa刺激0、4、8、12、24 h 后 LOVO 细胞中 MMP-7mRNA 的变化,Northern blot 证实时间效应及测定0、10、50、100、200 nmol/L FⅦa刺激后的 MMP-7mRNA 水平;100 nmol/L FⅦa分别刺激LOVO 细胞0、4、8、12、16、24 h,Western blot 测定 p-P38的水平;Northern blot 分别检测预先使用10 mmol/L P38阻断剂 SB203580 0.5 h 再以100 nmol/L FⅦa刺激 LOVO 细胞8 h 及100 nmol/L FⅦa刺激 TFRNAi LOVO 细胞系8 h 后 MMP-7mRNA 水平。结果 Northern blot 结果显示 FⅦa刺激MMP-7mRNA 表达存在时间、浓度依赖性;Western blot 测定 FⅦa刺激 p-P38表达存在时间依赖性。应用 P38通路阻断剂 SB203580后 MMP-7mRNA 基因表达下降59.2%,转染组织因子干扰质粒的LOVO 细胞中,MMP-7mRNA 的表达水平较 LOVO 细胞组下降48%。结论活性Ⅶ因子与组织因子结合诱导体外大肠癌 LOVO 细胞系表达 MMP-7mRNA,其机理可能与 P38通路有关。