凝血因子V基因Leiden突变和凝血酶原基因G20210A突变与下肢深静脉血栓形成关系的探讨

目的 :探讨凝血因子V基因G16 91A突变 (Leiden突变 )和凝血酶原基因G2 0 2 10A突变与下肢深静脉血栓形成的关系。方法 :采用PCR RFLP技术对 86例下肢深静脉血栓形成患者和 10 0例正常对照的健康人群进行凝血因子V基因G16 91A突变和凝血酶原基因G2 0 2 10A突变检测。结果 :86例下肢深静脉血栓形成患者和 10 0例正常对照组中均未检出凝血因子V基因G16 91A突变和凝血酶原基因G2 0 2 10A突变。结论 :凝血因子V基因G16 91A突变和凝血酶原基因G2 0 2

凝血因子V基因Leiden突变和早产儿脑室内出血的关系研究

目的研究凝血因子V基因Leiden突变和早产儿脑室内出血的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态分析的方法,对54例脑室内出血的早产儿及57例无脑室内出血的早产儿进行等位基因检测,并进行对比分析。结果54例脑室内出血组中有6例为基因Leiden突变杂合子(11%),而无脑室内出血的早产儿中的57例中只有1例为基因Leiden突变杂合子(1.8%),两组之间差异显著,χ2=4.11,P<0.05。结论凝血因子V基因Leiden突变携带者患脑室内出血的早产儿风险高于无脑室内出血的早产儿组。

凝血因子V基因Leiden突变与严重先兆子痫的关系研究

为探讨凝血因子Ｖ基因Ｌｅｉｄｅｎ突变与孕妇严重先兆子痫的关系。方法：采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态分析对３５例严重先兆子痫孕妇及９０例正常对照组孕妇进行等位基因检测。结果：３５例严重先兆子痫患者中有３人，为Ｌｅｉｄｅｎ突变杂合子（８．６％），而正常对照组中的９０人中只有１人为Ｌｅｉｄｅｎ突变杂合子（１．１％），二组间差异显著，ｘ２＝４．８９，Ｐ＜０．０５。结论：因子Ｖ基因Ｌｅｉｄｅｎ突变携带者患严重先兆子痫的风险高于正常组。

一种新的导致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的基因突变分析

目的:对一例遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症的患者及其家系进行基因分析,探讨其分子发病机制。方法:使用Sysmex-CS5100全自动血凝分析仪检测先证者及其家系成员(共3代8人)的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、D-二聚体、纤维蛋白降解产物以及血浆FⅦ的活性(FⅦ:C)水平;PCR法扩增先证者凝血因子Ⅶ基因(F7)所有外显子和侧翼序列,PCR产物纯化后测序,发现突变位点则反向测序给予证实;使用Clustal W软件对突变位点进行保守性分析;应用Mutation Taster和Poly Phen-2在线生物学软件评估突变氨基酸对FⅦ蛋白结构与功能的危害性;运用Swiss软件对突变建模分析。结果:凝血常规检查结果显示,先证者PT单独性延长至42.5 s;FⅦ:C明显降低,仅为2%;同样先证者外婆、母亲和妹妹的FⅦ:C都有轻度降低,分别为49%、51%和42%;父亲各指标均在正常参考范围。基因分析结果显示,先证者F7基因第6号外显子c DNA的646位发生G>A杂合突变,导致FⅦ催化区的156位甘氨酸被替换为丝氨酸(p.Gly156Ser)。F7其他外显子和侧翼序列的测序结果均正常。其外婆、母亲和妹妹均携带c.646G>A杂合突变,父亲为正常野生型。模型构建显示p.Gly156Ser突变使该位点氨基酸极性发生改变并出现侧链,从而使蛋白的不稳定性增加,可能影响所在结构域的催化活性。同时,Mutation Taster和Poly Phen-2两个在线生物信息学软件也高分预测该突变具有致病性。结论:该遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者FⅦ蛋白p.Gly156Ser错义突变与血浆FⅦ:C水平降低有关。

两个复合杂合突变导致遗传性凝血因子V缺陷症家系的表型与基因突变分析

目的:对两个由F5基因复合杂合突变导致的遗传性凝血因子V(FV)缺陷症家系进行表型和基因型分析,初步探讨其分子致病机制。方法:检测两个家系各成员外周血的血浆FV活性(FV:C)和FV抗原(FV:Ag)等凝血指标。通过PCR扩增F5基因的所有外显子及其侧翼区域,并进行测序。利用生物信息学软件辅助分析突变对蛋白功能的影响。使用PyMOL软件分析突变前后FV蛋白质的空间结构变化。通过凝血酶生成实验评估突变蛋白的功能变化。结果:表型检测显示两个先证者FV:C和FV:Ag均同步下降,表现为I型FV缺陷症。基因分析显示,先证者A第3外显子存在c.332G>T杂合错义突变(p.Ser111Ile)及第25外显子存在c.6665A>G杂合多态性(p.Arg2222Gly);先证者B第3外显子存在c.286G>C杂合错义突变(p.Asp96His)及第13外显子存在c.2393-2393del C杂合缺失突变(p.Pro798Leufs*13)。生物信息学分析显示,p.Ser111Ile和p.Pro798Leufs*13突变均为致病性突变。蛋白模型分析显示,p.Ser111Ile突变导致氨基酸间的氢键发生改变;p.Pro798Leufs*13突变产生了截断蛋白。凝血酶生成实验表明,先证者A和B的凝血功能已受到影响。结论:这四种突变可能是造成该两个家系FV水平下降的主要原因,其中p.Ser111Ile突变鲜见报道。

凝血因子XⅢ基因Val34Leu突变与脑出血神经功能的相关研究

目的 探讨凝血因子 XⅢ (FXⅢ )基因 Va134Leu突变与中国人群脑出血发病的相关关系。方法 利用等位基因特异性聚合酶链反应技术分析了 150例原发性脑出血病人和 150例非脑卒中对照组 FXⅢ基因的基因型位点频率。结果 在所研究的人群中发现了 4例 FXⅢ基因 Val34Leu突变的杂合子，全部位于脑出血组，没有发现突变型的纯合子。等位基因 Val34和 Leu34在所研究的中国人群中的频率分别是 99.3％和 0.7％。结论 FXⅢ基因 Val34Leu突变可能与中国人群的脑出血有潜在的关系。

两例先天性凝血因子V缺乏症基因突变的鉴定

目的探讨先天性凝血因子Ⅴ(FⅤ)缺乏症的分子发病机制。方法采用一期法检测血浆FⅤ活性, ELISA法检测血浆FⅤ的抗原含量,PCR法扩增FV基因的25个外显子及其侧翼序列,DNA测序并与Genebank校对确定基因异常。结果两例患者血浆FⅤ活性和抗原含量均为2％。病例1在FⅤ基因23外显子G 69969 T的纯合突变,导致G 2107 V;病例2由13外显子双杂合突变所致,其中一突变C 45533 T导致R 740 Ter,另一突变位点G 45366 A导致C 684 Y,这是国际上第一个位于13外显子的错义突变位点。分子结构分析表明684 Cys突变Tyr后,不能与603 Cys形成二硫键,影响了A2区β环状结构的形成,导致FⅤ的稳定性降低。结论FⅤ基因G 69969 T、C 45533 T及G 45366 A突变与先天性FⅤ缺乏症有关。

凝血因子Ⅷ基因Val 34 Leu突变与脑梗死关系的研究

目的 观察中国陕西汉族人群中凝血因子 (F )基因Val34Leu的变异 ,并探讨其与脑梗死发病的关系。方法 收集 6 5例陕西地区汉族脑梗死患者和 6 5名健康体检者的外周静脉血 ;采用酚 氯仿抽提技术提取基因组DNA ,聚合酶链反应 单链构象多态性分析与随机测序的方法检测基因的突变。结果 脑梗死组与健康对照组均不存在FVal34Leu的突变。结论 (1)中国陕西地区乃至中国的汉族人群中FVal34Leu的突变频率很低 ;(2 )

凝血因子V基因突变(1691G/A)与脑血栓、深静脉血栓相关性的研究

本文采用PCR扩增、限制性酶切及电泳分型等方法 ,检测了凝血因子V1691(G→A)突变在中国汉族人群体中的分布特点 ,并探讨了该突变同脑血栓、深静脉血栓等血栓性疾病的风险相关性。结论如下 :1 中国汉族人群中约有 1 96%携带突变基因 1691A ,墨西哥人中为 1 88% ,美国白人中为 1 89% ,美国黑人中为 0 % ,资料表明瑞典人群中约为 7% ,此结果提示该基因频率随种族、地区的不同而存在着差异。 2 深静脉血栓患者的FactorV 1691A基因频率为 0 .0 761与正常对照组(0 0 0 98)比较 ,统计结果RR =8.9798(u =2 .6648>2 .5 8,P <0 .0 1)两者差异显著 ,此结果表明该突变是静脉血栓的主要的风险因子。 3 脑血栓患者的FactorV 1691A基因频率为 0 .0 0 675 ,与正常对照组 (0 0 0 98)比较 ,统计结果RR =0 .6845 (U =-0 2 984<1.96 ,P >0 .0 5 ) ,此结果表明 ,该突变可能不是脑动脉血栓的主要的风险因子。

遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症合并蛇咬伤1例报告

目的报道并分析1例竹叶青蛇咬伤合并遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺乏症患者的临床资料,并对患儿及其家系成员进行FⅦ基因突变分析。方法应用Stago全自动血凝仪检测患儿凝血指标及FⅦ活性(FⅦ:C);提取患儿及其家系成员外周血基因组DNA,对FⅦ基因编码区及侧翼序列进行Sanger测序和生物信息学分析。结果患儿凝血酶原时间(PT)明显延长,FⅦ:C仅为3.0%。FⅦ基因测序发现患儿携带2个位于第9外显子的杂合错义突变:c.1034G>T(p.Gly345Val)和c.1224T>G(p.His408Gln),家系分析显示前者来源于父亲,后者来源于母亲。经查询,c.1034G>T(p.Gly345Val)突变在东亚人群数据库(ExAC_EAS)中尚无报道。结论FⅦ基因c.1034G>T和c.1224T>G双重杂合突变是导致该家系遗传性FⅦ缺乏症的分子致病机制,其中c.1034G>T(p.Gly345Val)为新发现的突变位点。

复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XI缺陷症家系分析

目的寻找复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XI(FXI)缺陷症患者家系的致病基因并初步探讨其分子致病机制。方法检测先证者及家系成员(共13人)血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血浆FXI活性(FXI:C)及FXI抗原(FXI:Ag)等指标;提取基因组DNA,用Sanger测序法分析先证者F11基因的全部外显子和侧翼序列,发现突变位点后反向测序予以证实,并检测家系成员相应的突变位点区域。ClustalX软件分析突变位点的保守性;用MutationTaster和PROXIEAN在线生物信息学软件预测突变位点对蛋白质功能的影响。用Swiss-PdbViewer软件构建突变蛋白模型。结果先证者APTT明显延长,为85.9 s,其FXI:C和FXI:Ag均降低,分别为2%和4.8%;其母亲、二哥、二姐、侄子、外甥女和儿子FXI:C和FXI Ag也有不同程度下降。先证者F11基因第8外显子存在c.841C>T(p.Gln263stop)杂合突变及第10内含子3'端剪切位点突变(IVSJ-4del gttg);其母亲、二哥、侄子携带p.Gln263stop杂合突变;其二姐、外甥女和儿子携带IVSJ-4del gttg杂合突变;其余家系成员均为野生型。保守性分析发现,p.Gln263stop氨基酸在6种同源物种中均位于保守区域;2个在线生物信息学软件均显示为致病的突变;蛋白模型分析显示,突变导致其产生截短蛋白。结论先证者p.Gln263stop协同IVSJ-4del gttg复合杂合突变是导致其FXI缺陷症的分子机制。

海南地区静脉血栓栓塞症患者活化蛋白C抵抗与凝血因子V基因多态性研究

目的了解海南地区静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)患者及健康人群活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance,APCR)情况以及可能的凝血因子V基因缺陷(FV Leiden、FV HongKong/Cambridge)。方法收集2014年1月至2017年1月在海南省人民医院住院的海南籍汉族VTE患者共计101名以及海南籍健康人群104名,检测两组人群中是否存在APCR现象,用多聚酶链反应-限制性内切酶长度多态性分析(PCR-RLFP)以及基因测序方法检测FV Leiden、FV HongKong/Cambridge基因。结果 VTE组APCR阳性率明显高于对照组(P <0. 05)。在101名VTE患者当中检出1例杂合突变FV Leiden和3例FV HongKong基因型,未发现纯合突变FV Leiden以及FV Cambridge基因型。对照组人群中未发现上述异常基因。结论 APCR可能是导致海南地区人群VTE发病的危险因素,FV Leiden基因在海南人群中少见,FV HongKong可能是海南地区VTE人群较特异的致病基因。

凝血因子Ⅶ基因突变的检测

目的 为检测福建省福州市一个遗传性凝血因子缺乏症先证者的因子Ⅶ基因突变类型。方法 采有ＰＣＲ结合限制性内切酶ＨｇｉＣＩ，以先证者及其母亲的 ＦⅦ基因片进行分析。结果表明先证者的 ＦⅦ基因为 Ｃ３２９Ｇ纯合子，其母亲为杂合子。结论 该家系为ＦⅦ基因存在Ｃ３２９Ｇ突变的第２个遗传性因子Ⅶ缺乏症家系。

错义突变Gly400Val导致的凝血因子Ⅺ缺陷症

目的 检测一个中国汉族人凝血因子Ⅺ (FⅪ )缺陷家系中的基因突变。方法 测定先证及家系成员凝血因子活性 (FⅪ :C) ;抽取外周血单个核细胞中的基因组DNA ,采用PCR扩增FⅪ基因所有外显子及其侧翼序列 ,直接测序 ;针对突变位点进行等位基因特异性PCR(ASPCR)扩增。结果 先证者部分凝血活酶时间(APTT)延长 94 .15s ,FⅪ :C为正常的 2 .1%。家系成员杂合子的FⅪ :C均下降 ,为正常对照的 2 7.0 %～4 8.4 %。先证者FⅪ基因外显子 11第 12 96位苷酸G突变为T ,导致其所编码的甘氨酸残基为缬氨酸残基替代(Gly4 0 0Val)。部分家系成员该位点呈杂合性改变。 结论 Gly4 0 0Val为FⅪ缺陷的原因 。

1例凝血因子Ⅺ缺乏症的基因突变研究

目的研究1例凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症患者的基因突变,揭示其分子发病机制。方法应用凝固时间法测定患者血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原含量(Fbg)、凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ促凝活性(FⅨ∶C)、FⅪ促凝活性(FⅪ∶C)及凝血因子Ⅻ促凝活性(FⅫ∶C);采用聚合酶链式反应(PCR)扩增产物直接测序的方法对患者FⅪ基因进行直接检测,鉴别其中可能存在的基因变异。结果患者血浆中APTT、PT、TT、Fbg含量、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅪ∶C及FⅫ:C分别为64.2s、12.8s、17.9s、3.8g/L、87.4%、71.2%、16.6%及80.2%,其FⅪ基因第13号外显子编码482位氨基酸的碱基发生杂合性的错义突变TGC→TGG(Cys482Trp)。结论 Cys482Trp的杂合突变可能是导致患者FⅪ缺乏的分子发病机制。

口服避孕药与凝血因子的变化及因子Ⅴ基因突变的关系

目的 探讨国产复方口服避孕药 (COC)与凝血因子的变化及因子V基因突变的关系。方法 测定 14 1例健康妇女凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ活性 ;分析女性脑卒中患者因子Ⅴ基因多态性。结果 炔诺酮组和炔诺孕酮组凝血因子X活性均数均显著高于对照组 (97 0 8± 14 78,P <0 0 5 ;98 5 8± 13 2 8,P <0 0 1) ;炔诺酮组凝血因子Ⅷ活性均显著高于对照组 (15 0 96± 5 7 11,P <0 0 5 ) ;二服药组凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ活性均数与对照组相似 ,差异无显著性 ;女性脑卒中患者中服避孕药者和非服避孕药者均未发现因子Ⅴ基因多态性。结论 长期服用国产低剂量COC对妇女的凝血因子有一些负面影响 ,不同避孕药的影响略有不同 ;COC不会引起中国妇女凝血因子ⅤLeiden突变。

重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义

本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义。将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上;利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体;将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N。结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功;通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功。结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等。

一个遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系F7基因信号肽区L12R和3＇＇非翻译区c11814-insAA复合性突变与表型分析

目的:通过对一个遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症患者家系成员表型与基因型分析,研究其基因突变与临床表型的关系,探讨其分子发病机制。方法:对先证者及其父母进行活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原和FⅦ活性(FⅦ:C)、FⅦ抗原(FⅦ:Ag)检测,对其F7基因的全部外显子及侧翼、启动子区进行测序,以寻找致病基因突变。根据信号肽预测数据库构建包含所发现突变的FVII蛋白分子模型,进行功能预测,推断其对蛋白合成和功能的影响。结果:先证者APTT正常,PT明显延长(58.3 s),FⅦ:C显著下降(1.1%),FⅦ:Ag重度降低(0.9%),其父母的APTT、PT、FⅦ:C和FⅦ:Ag均在正常范围内。先证者和其父亲的F7基因第1a外显子第556位核苷酸发生杂合性T/G突变,导致相应氨基酸由亮氨酸(L)变成精氨酸(R),即L12R。功能预测分析提示,L12R突变影响到信号肽区不同区域的分割及其相应功能,进而导致成熟蛋白质的合成减少和因子活性明显降低。同时,先证者F7基因还存在自发性3'非翻译区c11814-ins AA杂合性突变,而其父母均无此突变。结论:发现1例F7基因L12R突变,位于信号肽区的该杂合突变是导致此例遗传性FVII缺乏症发生的主要分子基础,而位于3'非翻译区的自发性c11814-ins AA突变则进一步造成了FⅦ合成的减低。

凝血因子Ⅴ Leiden突变检测对肺血栓栓塞症的预测价值

目的探讨我国东北地区肺血栓栓塞症(PTE)患者中凝血因子ⅤLeiden突变(FVL)的发生频率。方法病例组是81例经螺旋CT肺动脉造影(CTPA)或核素肺灌注显像结合临床症状确诊的PTE患者,对照组是81例年龄、性别相匹配,来自相同地区的健康人群。采用聚合酶链式反应(PCR)对实验组及对照组抽提出的DNA片段进行扩增,对确认扩增成功的PCR产物,用HindⅢ限制酶进行酶切,酶切产物行琼脂糖凝胶电泳检测FⅤL基因突变情况。结果两组凝血因子Ⅴ基因经HindⅢ酶切后,均仅出现241 bp一条带,FⅤL发生频率为0%,病例组与对照组相比无显著差异(P>0.05),病例组及对照组均未发现凝血因子V基因杂合子及纯合子突变。结论凝血因子ⅤLeiden突变在我国东北地区发生率低,可能对我国东北地区人群PTE诊断没有预测价值。