重组牛凝血酶原-2在大肠杆菌中的表达及包涵体的制备

将含凝血酶原-2的质粒成功地转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导培养,获得凝血酶原-2包涵体.经对培养基成分及操作条件进行优化,详细考察了碳源、氮源、无机盐、诱导起始时间、诱导剂添加量、接种量、发酵温度和转速等因素对目标蛋白表达量的影响.在优化的条件下,重组凝血酶原-2包涵体的产量为110mg/L发酵液,占菌体总蛋白的21.7%.

稀释复性法体外复性重组牛凝血酶原-2包涵体

对重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性进行了研究。凝血酶原-2是α-凝血酶生成过程中的一个最小的单链中间前体。重组牛凝血酶原-2在E.coli中高效表达并形成包涵体,经2.5mol?L?1脲和0.7%Triton X-100洗涤,再用8mol?L?1脲和0.3mol?L?1DTT溶解后,得到了包涵体裂解液。研究优化了体外复性溶液,其组成为含2.7mol?L?1脲、0.6mmol?L?1GSSG、GSSG/GSH0.9、0.1%PEG6000和0.5mol?L?1L-Arg、pH7.4Na3PO4缓冲液。牛凝血酶原-2复性后经透析,再被Echis Carinatus Snake Venom激活,转化为有活性的α-凝血酶,其总活力可达2948U?mL?1。结果表明稀释复性法可用于重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性。

毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析

目的通过毕赤酵母(Pichia pastoris)表达制备重组人凝血酶原2(prothrombin-2),并利用锯鳞蝰(Echis carinatus)凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶,分析凝血酶的活性。方法根据Gen Bank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列,设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体p PICZαA中,转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌,诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2,培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备,并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3.1(+),瞬转HEK 293T细胞,收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应,利用凝血酶发色底物S-2238,测反应产物的酶促活性;利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白,去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103,与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定,纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后,可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺(pNA),且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高;经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结,与凝血酶试剂的血凝时间接近,且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2,被ecarin活化为具有活性的凝血酶,有望替代从血浆中提取的凝血酶原,用于战伤救治和临床研究。