人凝血酶敏感蛋白1抗血管生成活性片段重组腺病毒高效制备

目的构建人凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1,TSP1)抗血管生成片段重组腺病毒。方法采用RT-PCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增编码TSP1抗血管生成活性片段(TSP1f)的cDNA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV上,以线性化重组穿梭载体与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组并酶切鉴定筛选正确重组子,用线性化重组质粒转染人胚肾293细胞,制备重组腺病毒ADV-TSP1f,最后以PCR及Westernblot方法鉴定TSP1抗血管生成片段的表达。结果细菌内同源重组共获得43个卡那霉素抗性克隆,经酶切鉴定表明其中直径最小的10个均为正确重组子,该重组质粒转染293细胞所获得的重组腺病毒可高效表达TSP1抗血管生成片段,纯化后病毒滴度为1.0×1011pfu/mL。结论细菌内同源重组法构建重组腺病毒高效快捷,所获得的ADV-TSP1f可进一步应用于抗肿瘤血管生成的基因治疗研究。

ADAMTS L1通过白细胞介素-6介导羊膜细胞凋亡对早产的潜在影响

目的研究含凝血酶敏感蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶L1(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin L1,ADAMTS L1)是否通过参与炎症调控过程影响羊膜细胞凋亡,从而成为早产发病的潜在影响因子。方法收集足月产、自发性早产的胎盘组织20例,将其分为足月分娩组和自发性早产组,每组10例。利用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法(Western blot技术)检测其中ADAMTS L1和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的mRNA及蛋白水平;体外利用PMA活化THP-1细胞系模拟炎症环境,并通过慢病毒敲降人羊膜细胞系WISH中ADAMTS L1(敲低组),检测其中ADAMTS L1及IL-6的mRNA及蛋白水平,比较其与空白组的差别。结果相较于足月分娩组,自发性早产组ADAMTS L1及IL-6的mRNA水平分别约增加了11、15倍,蛋白水平分别约增加了9、12倍;同时,敲低ADAMTS L1减少WISH细胞凋亡,与空白组相比,敲低ADAMTS L1后,凋亡相关蛋白caspase3 mRNA水平降至空白组的0.35,蛋白水平降至空白组的0.30。结论本研究利用体外实验评估了炎症过程中巨噬细胞分泌的IL-6可以调节ADAMTS L1,进而引起自发性早产。但是,需要进一步的研究来证实我们的发现。