尖吻蝮蛇毒和蝮蛇毒凝血酶样酶促凝的协同作用

尖吻蝮蛇毒和蝮蛇毒凝血酶样酶促凝的协同作用目的：尖吻蝮蛇（ＤＡ）和蝮蛇（ＡＨ）蛇毒凝血酶样酶（ＴＬＥ）对促凝作用的协同效果。方法：柱层析分离纯化ＴＬＥ并进行体外凝血试验。结果：一个凝血单位ＤＡＴＬＥ为２．７μｇ，ＡＨＴＬＥ为３０４．４μｇ。它们单独作...

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究 Ⅱ.酶学与血液学活性的研究

对四个凝血酶样成分(TLP)的酶学性质的比较研究表明,它们都具有凝结(血)活性和精氨酸酯酶活性。其凝结活力TLP_4>TLP_3>TLP_1>TLP_2,Ca^(++)有激活作用,但不被肝素、EDTA所抑制;精氨酸酯酶活力以TLP_1、TLP_2较高,Ca^(++)、EDTA无明显的激活或抑制作用;TLP_1对热比较稳定,TLP_4对于酸碱变化比较稳定。经动物体内试验表明,TLP_1、TLP_2具有较强的去纤抗凝作用,TLP_3、TLP_4不显示抗凝作用,而显示出较强的促凝血作用。结果表明,尖吻蝮蛇毒与美洲矛头蝮蛇毒一样,同时含有去纤酶(Defibrase)和蛇毒凝血酶(Hemocoagulase)。这一结果对该蛇毒的研究与应用是很有意义的。

尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶在兔体内的药物动力学

本文采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测(ELISA)技术,研究家兔一次快速iv 75,150及300μg/kg的凝血酶样酶(thrombin—like enzymes,TLEs)后24 h内血浆药物代谢动力学。结果表明,TLEs在家兔的血浆浓度时间过程以三室模型模拟较为合适,三种剂量的各参数的均数之间经F检验除中央室表观分布容积外无显著差别。其t_(1/2α)为3.86～5.12min,t_(1/2β)为43.3～59.8min,t_(1/2γ)为17.6～19.5h。

应用HPSEC法测定蛇毒凝血酶样酶纯度和分子量

在对全国蛇毒凝血酶样酶产品的全面考察后，本文报道了采用高效体积排阻色谱法对其纯度及分子量的测定结果．国内蛇毒凝血酶样酶样品的纯度达到９８％以上，分子量测定结果为３７５００±２０００．

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究——Ⅲ.蛇毒凝血酶止血效应的研究

将纯化得到的蛇毒凝血酶(TLE_3、TLE_4),经家兔体内实验表明,2—3凝血酶单位/kg体重剂量能显著地使家兔全血凝血时间缩短1/3—1/2。药后1小时即有促凝作用,以2—4小时凝血(止血)效应最强,12小时已消失。与Holleman, W. H.等自美洲矛头蝮蛇毒中得到的蛇毒凝血酶(Hemocoagulase)相似。经家兔及家犬实验性创伤止血实验表明,对创伤出血有止血作用。

^(131)I标记尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶在动物体内的分布

用氯胺T法对尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的抗血栓组分凝血酶样酶进行^(131)Ⅰ标记,观察其在大、小鼠体内的分布。以实验组和给予同剂量凝血酶样酶混合Na^(131)Ⅰ的对照组的放射性参入量(脏器与血液放射比)的比值作为凝血酶样酶在组织中分布的依据。结果表明,一次快速ⅳ凝血酶样酶后2h分布最多的为肾、其次为肺、脾、肾上腺和肝。给药后4h,肾、脾、肺和肝比2h时高,心脏含量较少,其它组织未见有分布。尿中含量高,表明其主要经肾脏随尿排泄;经胆汁排出则很少。

尖吻蝮(Agkistrodon acutus) 蛇毒凝血酶样成分的研究Ⅰ.分离纯化及其理化特性的测定

尖吻蝮蛇毒经DEAE—sephadex A-50柱层析分离得15个蛋白组分,将其具有凝血酶样活性组分再经DEAE—celluiose DE_(52),QAE—sephadex A-25纯化,再以Sephadex G-25脱盐得精制的凝血酶样活性成份。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为四条迁移率不同的单一蛋白带;再经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测得四种凝血酶样酶(TLE)的分子量,TLE;为33500,TLE;为68000,TLE;为19500,TLE;为30000;经等电聚焦电泳测得等电点(PL)分别为4.1,4.8,3.9,3.4,经氨基酸组成分析,四种TLE均由相同的17种氨基酸组成,但其组成氨基酸的数量则有一定的差异。结果表明,从尖蝮蛇毒中分离纯化的这四种蛋白成份,它们都具凝血(或凝结)活性,但在层析,电泳、组成氨基酸的含量等方面则存在显著的差异,因而它们是四种不同的TLE。这是本实验室首先发现并分离得到的,还未见有同时从尖蝮蛇毒中分离、纯化得到四个不同的凝血酶样酶的报道。

我国蛇毒凝血酶样酶的生物化学、药理学和临床应用

蛇毒对血液系统的作用早已为人们所关注,大量的实验研究和临床应用表明,蝮亚科蛇毒,特别是它们所含有的凝血酶样酶(Thro-mbin like Enzyme TLE)成份及其制剂:去纤酶(Defibrase)、抗栓酶(Svatel、2、3)和清栓酶都具有明显的抗凝、去纤、溶栓、抗血脂等功能,为临床应用提供了可靠的实验依据,取得了显著的临床效果。现结合我们的工作,对我国的蛇毒凝血酶样酶及其制剂的生物化学、药理学和临床应用近况作一介绍。一、蛇毒TLE的分离纯化由蛇毒所得的TLE绝大多数为酸性蛋白质,因而多采用阴离子交换剂及分子筛(葡聚糖凝胶)柱层析分离、纯化。常用阴离子交换剂为:DEAE-葡聚糖凝胶,DEAE-纤维素,QAE-葡聚糖凝胶,羟基磷灰石。

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样酶的分离、纯化及其生化药理研究

本文报道自尖吻蝮蛇中分离、纯化三个凝血酶样酶(Thrombin-like Enzymes,TLEs),TLE-A,TLE-Ⅵ及TLE-Ⅶ。双向免疫扩散分别出现单一沉淀线,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分别呈单一区带,并依此测定分子量分别为66、31及14KD。试管内TLES能使纤维蛋白原或血浆形成纤维强白微凝块。凝血酶样酶制剂(TLES)150μg/ml效价与牛凝血酶1.0U/ml接近。肝素不能对抗其凝血效应,以对甲苯磺酰精氨酸甲基酯(TAME)为底物,其精氨酸酯酰活力可达2000μmol/min·mg左右。动物在体实验中,犬(n=6)静脉注射100μg/kg后4h药效达高蜂,血浆纤维蛋白原含量明显降低(P<0.02),凝血酶时间明显延长,血浆副凝血试验强阳性,血小板聚集功能明显抑制,家兔(n=10)每日静脉注射300μg/kg连用7天,对血液凝固系统效应与犬相似。药后第8天处死家兔病理解剖无明显变化。小鼠一次静脉注射的LD_(50)及其95％可信限为14.5±2.2(12.3～16.6)mg/kg。

液相色谱分离纯化五步蛇毒凝血酶样酶

目的:改进分离工艺,找到液相色谱分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的最佳方案。方法:五步蛇毒依次经Superdex G75凝胶过滤、DEAE-Sephrose F.F阴离子交换和Superdex G30凝胶过滤,通过改变洗脱液pH值、流速、Tris浓度、盐浓度及上样量来考察对分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的影响。结果:Superdex 75凝胶过滤色谱分离纯化受洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量的影响;DEAE-Sephrose F.F阴离子交换色谱受盐浓度的影响;Superdex G30凝胶过滤色谱受上样量的影响。三步分离纯化后获得一种五步蛇毒凝血酶样酶,分子量约23kD。结论:依次经Superdex G75、DEAE-Sephrose F.F和Superdex G30凝胶,通过改变洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量等能得到最佳分离条件,最终可获得五步蛇毒凝血酶样酶的纯品。

蛇毒中凝血酶样酶的研究

蛇毒中凝血酶样酶的研究韦世秀广西医科大学蛇毒研究所南宁５３００２１许多蝮亚科蛇毒中都含有一种氨基酸酯酶［１］，它催化纤维蛋白原分子特定部位Ａｒｇ－Ｇｌｙ肽键的裂解，释出血纤肽而转换为纤维蛋白。其作用与血浆凝血酶十分相似，因而称之为凝血酶样酶（Ｔｈｒｏ...

竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒凝血酶样酶的分离纯化及其理化性质的研究

用CM—Sephadex C—25分离竹叶青粗毒,再经DEAE—Sephadex A—50和CM—Sephadex C—25纯化得到凝血酶样酶组分Ⅰ。用DEAE—Sephadex A—50分离竹叶青粗毒,再经DEAE—Sepharose CL—6B纯化得到凝血酶样酶组分Ⅱ。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,组分Ⅰ在两种电泳中均为一条带; 组分Ⅱ在两朴电泳中均为二条带,经切割后鉴定证明组分Ⅱ的二条带都是凝血酶样酶。组分Ⅰ的分子量为54,500,由261个氨基酸残基组成,其中Asp和Glu含量较高,含14％中性己糖,13.1％己糖胺和14.7％唾液酸,等电点为3.5,在280nm处的消光系数为E_(1cm)^(0.1％)=0.855。组分Ⅱ的分子量分别为54,000和47,000。经凝胶电泳分离后用过碘酸—Schiff's试剂染色,证明组分Ⅰ和组分Ⅱ都是糖蛋白。

竹叶青Trimeresurus stejnegeri蛇毒凝血酶样酶的酶学性质研究

本文报道从竹叶青蛇毒中纯化的两个凝血酶样酶(组分Ⅰ和组分Ⅱ)的酶学性质研究。结果表明二者在体外都能使人纤维蛋白原转变为纤维蛋白,具有精氨酸酯酶活性,都能水解凝血酶专一性底物。纤维蛋白平板法证明组分Ⅰ具有激活纤溶作用;组分Ⅱ同时具有激活纤溶和直接纤溶作用;组分Ⅰ和组分Ⅱ能缓慢降解纤维蛋白原的α链,随着作用时间延长,组分Ⅰ还能进一步部分降解纤维蛋白原的β链,活性中心探讨表明,组分Ⅰ的活性中心由丝氨酸蛋白酶部位和糖基部位组成。组分Ⅰ水解BAEE的最适温度为50℃,最适pH为8.6。

浙江产蝮蛇毒(Agkistrodon halys pallas venom)凝血酶样酶的性质及其对血凝和血脂的影响

从浙江产蝮蛇毒中分离出一种凝血酶样酶,该酶能明显地延长全血凝固时间,白陶土部分凝血活酶时间(KPTT),并降低了血浆中的纤维蛋白原水平,同时全血的比粘度和血浆的比粘度及血清中的胆固醇和β脂蛋白均有所下降.该酶不激活凝血因子ⅩⅢ.

蕲蛇蛇毒中凝血酶样酶的分离纯化与特性

蕲蛇粗毒经DEAE -SephadexA - 5 0、POROS 5 0HS及TSKG30 0 0SW分离纯化 ,得到 1个具有凝血酶活力的峰 .该峰经SDS -PAGE和PAGE检测均为一条带 ,分子量约 2 8.0kDa ,加DTT处理后 ,拆分为约 14.8kDa的亚基 .其凝血酶活力为 14.7NIHu/mg ,精氨酸酯酶活力为 2 1.98TAMEμmol/mg·min .该组分具有激活因子ⅩⅢ的活性 ,但没有明显的出血反应 .肝素不影响该组分的凝血酶和精氨酸酯酶活性 ,EDTA、PMSF、DFP则会产生不可逆抑制作用 ,表明该组分属于金属蛋白 .

硫酸铵盐析在蕲蛇毒凝血酶样酶分离中的应用

探讨了硫酸铵沉降对蕲蛇毒中凝血酶样酶的初步分离效果的影响 ,确定出最佳处理条件 :2 .0 %的蕲蛇毒在pH 5 .0及 4 5 %饱和度的硫酸铵溶液中盐析沉降蕲蛇毒中非凝血酶样酶杂蛋白 。

五步蛇毒凝血酶样酶分离纯化

目的:探讨从五步蛇毒中分离纯化凝血酶样酶的有效方法。方法:用Superdex 75、Superdex 30凝胶过滤色谱和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱技术层析,SDS-PAGE分析纯度。结果:从五步蛇毒中分离纯化得到一个具有凝血活性的组分。SDS-PAGE显示为单一条带,相对分子质量约25 kDa。结论:用Superdex75、Superdex30凝胶过滤色谱和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱技术可以很好分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶。

应用比浊法测定凝血酶样酶活性

传统常用目测法观察血浆凝固时间来测定凝血酶样酶的活性，因无法微观地检测凝固过程的起始而导致灵敏度低．应用比浊法检测凝血酶样酶活性，以东菱克栓酶为标准凝血酶样酶，在血浆凝固过程中，浊度随时间基本呈直线变化直至浊度变化最终趋于恒定，表明此时血浆已完全凝固．酶活与浊度一时间变化曲线的直线斜率之间存在严格的线性关系．线性范围为０．０５～０．６５ｕ／ｍＬ．结果表明，比浊法是一种改进的凝血酶样酶测活方法．

尖吻蝮蛇毒38k凝血酶样酶的分离纯化工艺

建立从尖吻蝮蛇毒中分离纯化38k凝血酶样酶的生产工艺,利用离子交换和凝胶过滤技术,中间品加入巯基乙醇处理后,再利用凝胶过滤技术除去性质相近的杂蛋白,获得的38k凝血酶样酶HPLC纯度达99.93%,比活力达4416U/mg,出血毒试验800U/ml无出血,所建立的分离纯化方法适合规模生产。

iPSC-MSCs体外抑制ADAMTS保护骨关节炎患者软骨基质

目的研究诱导多能干细胞来源的间充质干细胞(iPSC-MSCs)体外对膝骨关节炎(KOA)患者软骨基质的保护作用及其部分机制。方法收集KOA患者关节置换手术切除的软骨组织,分别进行组织和细胞实验。软骨组织剪成小块,随机分为对照组、白介素-1β(IL-1β)诱导组和iPSC-MSCs组。除对照组外,各组软骨组织予以IL-1β(10 ng/ml)刺激96 h,再与不同数量iPSC-MSCs(1×10^(4),1×10^(5),1×10^(6))细胞共培养72 h后取出软骨组织进行石蜡包埋切片,免疫组化法检测组织中带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚蛋白样金属蛋白酶家族(ADAMTS-4、ADAMTS-5)及Ⅱ型胶原(COL2)表达,ELISA法检测共培养上清中基质金属蛋白酶13(MMP13)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)水平,苏木精伊红(HE)染色检测离体软骨组织的病理改变。分离KOA患者软骨组织中软骨细胞,经IL-1β(10 ng/ml)刺激48 h后,将软骨细胞与不同数量iPSC-MSCs(1×10^(4),1×10^(5),1×10^(6))共培养72 h。免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测软骨细胞中矮小相关转录因子2(RUNX2)、ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达。结果与对照组比较,IL-1β可诱导软骨组织RUNX2、ADAMTS-4、ADAMTS-5水平升高、COL2水平降低,培养上清中MMP-13、IL-6水平升高(P<0.05),IL-10水平减少(P<0.05);与IL-1β诱导组比较,不同数量iPSC-MSCs共培养可降低上清中MMP-13、IL-6水平,降低RUNX2、ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达,促进COL2表达,并升高IL-10水平。结论iPSC-MSCs体外可抑制ADAMTS-4、ADAMTS-5表达,减少软骨细胞外基质降解,起到关节软骨保护作用。