凝血酶生成试验检测技术及临床应用进展

凝血酶是凝血系统的关键功能分子。凝血酶生成试验(TGA)是检测在血浆促凝因子和抗凝因子共同作用下,凝血酶生成量的动态变化。相较于常规凝血试验(如PT和APTT),TGA最大的优势在于其是对凝血过程全貌的检测,因此其更能反映体内实际的凝血功能状态。TGA自1953年首次提出以来,在检测技术方面已取得显著进步,全自动检测设备及商品化试剂的开发进一步促进了其在临床的普及推广。近年来,诸多研究发现TGA在出血性疾病和血栓性疾病中均表现出潜在的应用价值,可以辅助疾病的诊断、预后评估并指导治疗。此外,新近研究发现TGA可能用于指导新型冠状病毒感染患者的抗凝管理。本文首先概述TGA检测技术发展过程,进一步对TGA临床应用进展进行综述。

凝血酶生成试验及凝血因子监测在老年创伤性骨折病人术后下肢深静脉血栓形成中的预测价值分析

目的分析凝血酶生成试验及凝血因子监测在老年创伤性骨折病人术后下肢深静脉血栓(DVT)中的预测价值。方法2019年3月~2022年3月我科行手术治疗且年龄>60岁的创伤性骨折病人104例。按术后5天超声检查是否发生DVT分为DVT组与非DVT组,比较两组病人一般基线资料、慢性疾病史、创伤至手术时间、凝血酶生成试验及凝血因子相关指标的差异;将差异有统计学意义的指标进行受试者工作曲线(ROC)分析;将差异有统计学意义的指标进行Logistic回归分析并计算预测概率,将预测概率进行ROC曲线分析。结果DVT的发生率为21.12%,与非DVT组比较,DVT组病人创伤至手术时间更长,在5 pmol/L组织因子(TF)激活条件下的峰值更低(258.13±40.88 vs 209.58±30.09),凝血因子FⅤ、FⅧ及纤维蛋白原(Fib)更高(分别为141.25(125.38,158.18)vs 176.12(150.65,186.34)、145.49(133.36,147.48)vs 165.96(153.07,180.65)、3.25±0.55vs 3.92±0.72),差异均有统计学意义(P<0.01)。ROC曲线分析显示,创伤至手术时间、5 pmol/L TF激活条件下的峰值、FⅤ、FⅧ、Fib 5个指标联合预测的AUC为0.91(P<0.01),高于单一指标预测,敏感度为0.82,特异度为0.92。结论创伤至手术的时间、5 pmol/L TF激活条件下的凝血酶生成峰值、FⅤ、FⅧ、Fib对老年创伤性骨折病人术后下肢DVT均有预测价值,联合检测预测价值更大。

凝血酶生成试验在血友病患者中的应用

目的:探讨凝血酶生成试验在血友病患者中的应用。方法:收集134例血友病患者[其中血友病A(HA) 114例,血友病B(HB)20例]的临床资料,根据FⅧ:C/FⅨ:C不同,将无FⅧ/FⅨ抑制物的132例HA/HB患者分成重型(FⅧ:C/FⅨ:C<1%)、中型(FⅧ:C/FⅨ:C 1%～5%)及轻型(FⅧ:C/FⅨ:C 6%～25%)3组,检测凝血酶生成、FⅧ:C/FⅨ:C及其抑制物。结果:重型HA/HB患者与轻型者比较,出血频度及凝血酶生成各指标差异均有统计学意义(P<0.01);而重型者与中型者比较,除延迟时间和达峰时间差异有统计学意义外(P<0.01),其余指标差异均无统计学意义;中型者与轻型者比较,除延迟时间和达峰时间差异无统计学意义外,其余指标差异均有统计学意义(P<0.01)。HA/HB患者的出血频度与FⅧ:C或FⅨ:C无关(P=0.16),而与凝血酶生成潜力(ETP)密切相关(P=0.0001)。结论:凝血酶生成试验可作为预测HA/HB患者出血风险的有效手段。

凝血酶生成试验在预测血管性血友病患者出血倾向中的作用

目的:评估凝血酶生成试验(thrombin generation test,TGT)在预测血管性血友病(von Willebrand disease,vWD)患者出血倾向中的应用价值。方法:选取2018年1月至2019年7月就诊于上海交通大学医学院附属瑞金医院的vWD患者38例,并根据出血严重程度分为轻度出血组(包括8例1型患者)、中度出血组(包括8例2A型和6例2M型患者)和重度出血组(包括2例2N型、6例重型1型和8例3型患者)。另选同期相同年龄段的5名健康体检者作为正常对照组。采集乏血小板血浆,分别检测患者与正常对照者间在1 pmol/L组织因子(tissue factor,TF)和5 pmol/L TF试剂激活下的凝血酶生成能力的差异,并分析TGT各参数[凝血酶生成峰值(以下简称峰值)、凝血酶生成潜力(endogenous thrombin potential,ETP)、达峰时间(time to peak,tt Peak)等]与患者血浆血管性血友病因子(von Willebrand factor,v WF)抗原(vWF∶Ag)水平、vWF活性水平(vWF∶Act)及凝血因子Ⅷ活性(FⅧ∶C)间的相关性。结果:在1 pmol/L TF激活下,正常对照组的峰值显著高于轻度出血组、中度出血组及重度出血组(P<0.05),重度出血组的峰值显著低于轻度出血组及中度出血组(P均<0.01),ETP和tt Peak仅在重度出血组与其余各组间差异有统计学意义(P均<0.01)。在5 pmol/L TF激活下,各组间峰值差异缩小,且正常对照组与轻度出血患者组的峰值间差异无统计学意义(P>0.05),ETP、tt Peak值在各组间差异均无统计学意义(P>0.05)。此外,在1 pmol/L TF激活下的峰值与患者FⅧ:C间的相关性最好(相关系数R^2为0.65);在1 pmol/L、5 pmol/L TF激活下,TGT参数(ETP和tt Peak)与患者vWF∶Ag、vWF∶Act间的相关性较弱(R^2<0.5)。结论:1 pmol/L TF激活下TGT参数的峰值可较好地反映不同出血严重程度vWD患者的出血倾向。

应用凝血酶生成试验评估肝硬化患者血栓形成风险的研究

目的研究抗凝血因子和促凝血因子对凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶生成试验(TGA)结果的影响,探讨TGA用于评估肝硬化患者血栓形成风险的价值。方法收集93名肝硬化患者和50名健康人群的血液标本,分别进行凝血象、凝血活酶、抗凝因子和抗凝血酶的测定。TGA利用荧光读数仪测定,通过软件监测绘制样本的凝血酶生成曲线。结果 PT受凝血因子(F)Ⅱ、FⅤ、FⅦ、FⅨ和蛋白C浓度的影响,而APTT结果主要由FⅡ、FⅨ和FⅩ决定。在5pmol/L组织因子(TF)的TGA反应体系中,凝血酶生成潜力(ETP)比值受FⅡ、抗凝血酶和蛋白C水平的影响,并且肝硬化组与对照组之间没有明显差异;而在1pmol/L TF反应体系中ETP比值主要由FⅨ和蛋白C决定,肝硬化组与对照组的ETP比值差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PT和TGA受凝血和抗凝因子的调控,并且TGA实验对于蛋白C浓度变化较为敏感;TGA能够在PT延长的情况下,提示肝硬化患者存在血栓形成的风险,TGA可作为临床评估肝硬化患者血液高凝状态的敏感指标。

凝血酶生成试验与常规凝血功能检测对血浆样本测试结果的相关性分析

目的探讨凝血酶生成试验（TGA）与常规凝血功能检测的关系,并比较TGA和活化部分凝血活酶时间（APTT）对普通肝素抗凝血浆检测的相关性。方法 1） 143例患者血液样本按凝血检验要求进行处理后,进行TGA及常规凝血功能检测（APTT、PT-INR、FIB、TT）; 2）对外加普通肝素的混合血浆进行TGA和APTT检测,重点分析APTT、Peak、AUC与血浆样本中肝素含量的关系。以上检测结果采用线性相关性与回归、多元线性回归与偏回归进行分析,评价各参数间的相关性。结果 1） TGA主要参数：延迟时间（t Lag）、达峰时间（t Peak）、峰值（Peak）、曲线下面积（AUC）均与PT-INR、APTT显著相关（0. 61≤r≤0. 79）;多元回归分析,TGA参数与常规凝血功能检测项目具有相关性。2） t Lag与t Peak（r=0. 91）高度相关,且Peak与AUC（r=0. 95）也高度相关;多元回归分析TGA参数间t Lag和t Peak,Peak和AUC之间相互影响。3） APTT、Peak、AUC和肝素浓度显著相关。结论 t Lag与t Peak,Peak与AUC具有高度相关性; TGA各参数与常规凝血测试（PT-INR、APTT）显著相关,将TGA检测手段用于监测肝素抗凝治疗的前景值得进一步研究。

血栓弹力图、凝血酶生成试验和血栓动力学分析研究进展

在静脉血栓栓塞及血小板减少等疾病中,出血与血栓形成是造成患者死亡的重要原因。因此,及时评估出血及血栓形成的风险和监测抗凝药物或止血药物的治疗效果就变得至关重要。传统的凝血检测指标[活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、国际标准比值(INR)]不能全面地反映体内凝血过程,因而不能可靠地用于预测体内的出血、凝血情况。全凝血试验如血栓弹力图、凝血酶生成试验和血栓动力学分析因可以反映凝血全过程,被认为较传统凝血试验能更有效评估出血及血栓形成风险。本文对血栓弹力图、凝血酶生成试验和血栓动力学分析3种全凝血试验的原理进行综述,阐述其与传统凝血试验相比的优势,以及目前存在的局限性,以期最大限度地发挥临床应用价值。

凝血酶生成试验研究进展及临床价值

心血管疾病是全球最常见致死病因,其中血栓栓塞性疾病具有较高致残率和病死率[1]。血栓形成是血栓栓塞的前提,可导致心肌梗死、脑卒中、深静脉血栓栓塞和肺栓塞等并发症,严重影响患者生活质量。凝血因子与抗凝成分之间的失衡可导致血栓形成,传统凝血检测不能对凝血平衡进行相关的表征且无法早期评估风险。凝血酶是维持凝血平衡的关键酶,反映了整体凝血状态[2]。

应用凝血酶生成试验在筛查特发性胎儿生长受限中的价值

目的探讨凝血酶生成试验(TGA)早期预测特发性胎儿生长受限(IFGR)中的意义及其对胎儿超声脐动脉(UA)诊断IFGR的补充诊断价值。方法选择2016年4月-2019年4月自孕早期温州市人民医院定期产前检查的孕妇进行前瞻性研究,将符合IFGR诊断标准孕妇56例纳入IFGR组,并随机选择同期经临床及超声确定的宫内健康发育孕妇161例纳入正常对照组;比较分析两组一般资料和早、中、晚孕期TGA参数:延迟时间(Lag time)、峰值(Peak)、达峰时间(tt Peak)和凝血酶生成潜力(ETP)、速率(Velocity)、拖尾时间(Start Tail)及孕20~24周、孕30~34周、孕35~40周UA血流参数:搏动指数(PI)、阻力指数(RI)及收缩期最大血流速度与舒张末期血流速度比值(S/D)的差异,采用受试者工作曲线(ROC)分析各指标对IFGR的诊断效能。结果孕早期ETP、Peak、tt Peak两组间比较差异均有统计学意义(P<0.05),孕中期ETP两组间差异有统计学意义(P<0.01),孕中期Peak、tt Peak,两组间差异无统计学意义(P>0.05),孕早、中、晚期Lag time、Velocity、Start Tail两组间差异无统计学意义(P>0.05)。孕30~34周、孕35~40周PI、RI、S/D两组间差异均有统计学意义(P<0.01),孕20~24周PI、RI、S/D两组间差异无统计学意义(P>0.05)。ROC曲线分析结果显示孕早期ETP、Peak、tt Peak及孕中期ETP ROC曲线下面积(AUC)分别为0.803、0.666、0.734、0.649 (P<0.05)。孕30~34周、孕35~40周PI、RI、S/D诊断IFGR的ROC曲线AUC分别为0.747、0.759、0.764、0.717、0.687、0.688 (P<0.01)。孕早期ETP、Peak、tt Peak三项联合的ROC曲线AUC为0.834 (P<0.01),孕30~34周、孕35~40周PI、RI、S/D三项联合的ROC曲线AUC分别为0.796、0.774 (P<0.01)。结论 TGA参数ETP、Peak、tt Peak在IFGR孕妇孕早期出现变化,可能提示其为IFGR高危因素,因此可使用TGA作为IFGR早期筛查指标,并与UA联合应用可提高IFGR的诊断效率,作为UA的补充。

静注人免疫球蛋白产品中活化Ⅺ因子活性凝血酶生成试验检测方法的建立

目的建立静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)中活化Ⅺ因子(activated factorⅪ,FⅪa)活性凝血酶生成试验(thrombin generation assay,TGA)的测定方法。方法采用自动校正凝血酶生成(calibrated automated thrombogram,CAT)分析仪,建立IVIG中FⅪa活性检测方法,并确定方法的线性范围和检测限,验证方法的精密度和准确性。采用建立的方法对4家血液制品公司的29批IVIG产品进行FⅪa活性定量测定。结果 FⅪa浓度在3. 34～27. 84 mIU/mL范围时,与凝血酶峰值浓度(peak thrombin concentration,PTC)呈良好的线性关系,回归方程为Y=-0. 022 8 X^2+1. 891 6 X+10. 282,R^2=0. 989;检测限为2. 76 mIU/mL;供试品的6次测定结果 RSD为12. 9%;低、中、高浓度加标样品的回收率分别为86. 7%、116. 7%、121. 6%,RSD分别为16. 4%、19. 8%、8. 4%。29批IVIG产品中,不同厂家及相同厂家不同批次间FⅪa活性均存在一定差异。结论建立了用于检测IVIG产品中FⅪa活性的TGA方法,且具有良好的线性、精密性及准确性,可用于评价IVIG产品的致血栓风险。

体外组织因子微颗粒的表达及其促凝活性的分析

目的体外细胞系培养刺激获得组织因子微颗粒(TF+MP)并对其促凝活性进行研究。方法用不同浓度脂多糖(LPS)刺激人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1),梯度离心后重悬分离获得微颗粒(MP);在正常人去MP血浆中加入MP,采用凝血酶生成试验分别检测组织因子(TF)和磷酯酰丝氨酸(PS)的凝血酶生成能力;采用ZYMUPHEN MP-TF试剂盒检测TF阳性的MP中TF的促凝活性,选用0.45和0.65μm的滤膜滤过MP,分别检测直径<0.45和<0.65μm的MP颗粒的促凝活性。结果凝血酶生成试验和发色底物功能检测结果显示体外表达的MP具有促凝活性。凝血酶生成试验结果表明MP的凝血活性与LPS的刺激呈浓度依赖性增强。直径>0.65μm的MP颗粒具有较强的促凝活性。结论体外经THP-1单核细胞系培养表达MP具有一定的促凝活性。

遗传性凝血因子Ⅴ缺乏基因型和表型的关联研究

目的·对遗传性凝血因子Ⅴ缺乏(inherited factor Ⅴ deficiency,FⅤD)患者进行临床表型诊断、凝血酶生成试验(thrombin generation assay,TGA)及FⅤ基因(F5)分析,综合评估患者的临床出血风险,探讨其基因型和表型的关系。方法·选取2020年1月—11月于广州医科大学附属第二医院血液内科门诊的FⅤD患者5例,常规凝血筛查法检测患者的凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin,APTT);一期凝固法检测血浆FⅤ活性水平(FⅤ∶C)和血浆FⅧ活性水平(FⅧ∶C);酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆FⅤ抗原(FⅤ∶Ag)以及游离和总组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)水平。依照出血评分表对患者的出血风险进行评分,结合TGA评估FⅤD患者临床出血风险。用Sanger测序法分析患者F5的全部外显子及侧翼序列,并对突变位点进行反向测序验证。采用AccuCopy多重基因拷贝数检测技术对FⅤD患者F5进行拷贝数变异(copy number variation,CNV)检测。结果·5例先证者均属于Ⅰ型FⅤD,其中有2例为重型FⅤD(FⅤ∶C<1%);5例先证者的游离和总TFPI水平均有不同程度的降低;TGA结果延迟时间和达峰时间均明显延长,但峰值和凝血酶生成潜力水平在不同患者间有较大差异。F5突变分析发现8种突变,类型包括错义突变、无义突变、移码突变、CNV,其中错义突变占75%;p.Cys603Ser、p.Leu949Trpfs*、p.Leu1262_Gln1657del为新突变;CNV检测到先证者2的13~14外显子的大片段缺失(c.3784_4971del、p.Leu1262_Gln1657del),mRNA水平进一步分析提示缺失导致患者mRNA剪接异常,产生新的剪切位点,进而表达3种异常转录本(c.3577_4971del、c.3577_4456del、c.3331_4456del)。结论·重型FⅤD患者体内FⅤ∶C水平和出血严重程度无关,TGA和出血评分表可较好地关联患者的出血风险。FⅤD的出血严重程度或与F5突变类型有关。

6个遗传性凝血因子Ⅹ缺陷症家系的表型与基因型诊断

目的:探讨6个遗传性凝血因子Ⅹ(factor Ⅹ, FⅩ)缺陷症家系的分子发病机制,并采用凝血酶生成试验(thrombin generation test, TGT)评估FⅩ缺陷症患者的出血风险。方法:收集6例先证者及相关家系成员的临床资料,凝固法检测内源性、外源性以及共同途径激活的FⅩ活性(FⅩ∶C),酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测FⅩ抗原(FⅩ∶Ag),采用蛋白印迹法检测血浆中的FⅩ相对分子质量及含量,直接测序法检测FⅩ基因(F10)突变,采用TGT检测6例先证者及部分家系成员血浆中的凝血酶生成。结果:在6例先证者中共发现了10种F10突变,其中5种(p.Cys246Ser, p.Tyr319Cys, p.Leu252Phe, p.Arg313Gln以及IVS5-2A>G)为新突变,其余5种(p.Phe71Ser, p.Val338Met, p.Gly406Ser, p.Gly365Ser, p.Cys151Arg)为已报道突变。TGT显示凝血酶生成潜力(endogenous thrombin potential, ETP)及峰值这2个参数与FⅩ缺陷症患者临床出血表现的严重程度具有一定关联。结论 :共发现5种F10基因新突变;5例遗传性FⅩ缺陷症患者由F10双杂合突变所致,1例由F10单杂合突变所致;在浓度为1 pM(1 pmol/L)组织因子(tissue factor,TF)激活下的TGT中,测得的ETP及峰值这2个参数可用于评估FⅩ缺陷症患者的出血倾向,对于了解该病患者的临床出血风险有一定的参考价值。

一个遗传性凝血因子Ⅹ缺陷症家系的临床特征与基因突变分析

目的探讨一个遗传性凝血因子Ⅹ(FⅩ)缺陷症家系的临床特征与基因突变关系。方法调查家系,采用Sanger测序法分析先证者F10基因8个外显子及其侧翼序列,并对家系成员相同突变位点进行检测。通过凝血酶生成试验评估家系成员FⅩ的促凝活性。ClustalX-2.1-win和在线生物信息学软件(PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster)分别用于分析突变位点氨基酸的保守性和致病性;Swiss-PdbViewer软件用于蛋白质空间结构和突变氨基酸相互作用分析。结果先证者FⅩ活性(FⅩ:C)和FⅩ抗原(FⅩ:Ag)分别降低至7%和14%(参考范围分别为:90%~114%和90%~110%);先证者平素无自发性出血现象,外伤后也无明显出血异常。基因测序发现先证者F10基因第4号外显子存在c.361T>C(p.Cys121Arg)杂合错义突变及第8号外显子存在c.979C>T(p.Arg327Trp)杂合错义突变;其母亲和女儿为p.Arg327Trp的杂合子,二姐和儿子为p.Cys121Arg的杂合子。先证者凝血酶生成潜力比值和峰高比值下降,而其延迟时间和达峰时间延长。保守性分析显示,p.Arg327和p.Cys121位点在同源物种间均高度保守。生物信息学软件预测两种突变均为致病突变。突变蛋白模型分析显示,p.Arg327Trp突变后,导致蛋白质空间结构和稳定性发生改变。结论该先证者F10基因p.Arg327Trp和p.Cys121Arg复合杂合突变与其FⅩ水平减低有关;该复合杂合突变与临床出血症状相关性不明显。

髋关节病灶清除术术后出血不止一例

我院于1983年遇1例因右髋关节滑膜切除和病灶清除术后出血不止而死亡的病例,为吸取经验教训,兹报道与探讨如下。病历简介患者男,14岁。入院前1个月无任何原因出现右髋关节疼痛,逐日加重。一周后出现右髋关节活动障碍,但无红肿、压痛等征象。病后伴体力下降,食欲不佳和低热。既往史中5年内经常有反复大关节肿痛史,以左髋关节肿痛为常见,曾在某医院诊断为左髋关节结核。体检:T37.1℃,P100,BP130/80。全身皮肤未见出血点和淤斑,头面部正常,心肺正常,腹平软,肝脾未触及。右髂窝可触及一个若鹅卵大小的肿物,有压痛。右髋关节呈屈曲状,不能伸直,伴压痛。