凝血酶适体DNA四螺旋构象去折叠机制的NMR研究

凝血酶适体DNA[thrombin binding DNA aptamer d(G1G2T3T4G5G6T7G8T9G10G11T12T13G14G15),TBA]是对凝血酶有极高亲和性、并能有效抑制凝血酶凝血功能的单链DNA适体.凝血酶适体DNA在K+等离子存在时呈现出椅式构象,其中2个堆积的四碱基体(G-quartet)构成椅子的主体部分,而1个TGT loop环和2个TT loop环分别构成椅子的靠背和椅脚.我们测定了在K+存在时凝血酶适体DNA中亚氨基质子的交换速率,发现位于TGTloop环和TT loop环内的亚氨基质子G6、G5和G14由于受TGT loop环和TT loop环的保护有比较小的交换速率,而位于环之外的亚氨基质子G2、G11和G15有较大的交换速率;TGTloop环稳定性同TT loop环相似;碱基T4、T13和T9在稳定凝血酶适体DNA结构中起着很大的作用.这些证据进一步支持了凝血酶适体DNA的去折叠机制:位于TGT loop环和TTloop环之外的碱基对G1-G15、G2-G14和G5-G11首先断裂其Hoogsteen氢键,而TGT loop环、TT loop环和其内的Hoogsteen氢键保持完好;当温度进一步升高时,TGT loop环和两个TT loop环打开环状结构,凝血酶适体DNA的椅式构象彻底解体,转变为自由单链.

单分子荧光成像研究凝血酶核酸适体的折叠

通过对固定在表面的TMR标记凝血酶核酸适体进行单分子荧光成像,在单分子水平上研究了凝血酶核酸适体的折叠.在有K+存在的条件下,核酸适体分子与K+结合后发生折叠,形成G四分体结构,使得TMR靠近富含鸟嘌呤的G四分体,并与鸟嘌呤发生电子转移,从而导致TMR荧光强度降低.根据TMR的单分子荧光强度观察到不同K+浓度下核酸适体在折叠和无规卷曲两种状态下的分布.结果表明,可利用电子转移引起的荧光强度变化在单分子水平上研究核酸适体构象变化,这一新方法的建立是对常用的单分子荧光共振能量转移(FRET)法的重要补充.

结晶紫光谱探针法无标记检测Pb^(2+)的DNA生物传感器

基于Pb^(2+)与凝血酶适配体(Thrombin Aptamer,TBA)特异性结合,以及结晶紫(CV)与凝血酶适配体、G-四链体结合后荧光信号的差异,建立了一种简单、灵敏、无需标记检测Pb2+的DNA生物传感器。实验研究了不同浓度的Pb^(2+)引起CV/TBA体系荧光强度变化的规律,考察了DNA序列、TBA与CV浓度比,以及稳定时间等因素对检测灵敏度的影响。实验结果表明:大多数金属离子无明显干扰,在最优实验条件下,Pb^(2+)浓度在5~50nmol/L范围内与体系荧光强度的变化呈良好的线性关系(r=0.9984),检测限(S/N=3)为2.0×10^(-9) mol/L。

TBA-Pb^(2+)-hemin模拟酶催化显色法测定水中痕量铅

在pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中,凝血酶适体(TBA)与Pb2+形成复合物,再与氯化血红素(hemin)配位结合,形成辣根过氧化物模拟酶,能催化H2O2氧化2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS),生成蓝绿色自由基产物,导致体系在415 nm处吸光度值增加,且在1.07×10-10~6.01×10-7mol/L范围内△A值与Pb2+浓度有良好线性关系,其回归方程为△A=0.409 c(×10-9mol/L)+40.7,相关系数r=0.996 6,检出限为3.21×10-11mol/L,相对标准偏差在0.67%~3.45%。用于环境水样测定,回收率在98.2%~102.7%。该方法特异性好、灵敏度高。

小分子直接凝血酶抑制剂研究进展

小分子直接凝血酶抑制剂是一种重要的抗凝防栓药物,一般通过化学合成的方法制备,相对分子质量在100~1 000之间。这类药物可选择性的与凝血酶活性位点结合,抑制凝血酶活性,作用强,特异性高,在临床治疗血栓类疾病中具有重要意义。近年来,已成功开发了多种小分子直接凝血酶抑制剂用于临床,其主要的给药方式为静脉注射和口服,治疗效果优于传统抗凝药物。文章就小分子直接凝血酶抑制剂的现状进行综述,并展望其今后发展方向。