洋刀豆植物蛋白中凝集素的灭活研究

洋刀豆蛋白是一种具有较高营养价值的植物蛋白质,但是其中含有的一些抗营养因子,例如血球凝集素(Concanavalin A,简称ConA)、胰蛋白酶抑制剂等,限制了它在人类食用植物蛋白和动物饲料中的应用,其中ConA是最主要的抗营养因子。本文主要研究洋刀豆植物蛋白中的ConA的灭活方法。分别利用干热、湿热和茶多酚处理法灭活ConA。实验表明,在保持洋刀豆蛋白质良好品质的条件下,干热处理不能使ConA的活力明显丧失;而95℃、30min,100℃、20min或105℃、10min的湿热处理,可使ConA的活力完全丧失;洋刀豆蛋白液中茶多酚浓度达到17.5mg/ml时,也可完全灭活ConA的活力。

外源性凝集素对糖蛋白和糖脂糖链结构的识别及其临床应用

对糖蛋白和糖脂糖链结构的测定已经成为临床实验室诊断疾病,尤其是肿瘤诊断的一个新的方向。外源性凝集素是分析糖链结构最常用和有效的工具。本文综述了多种常用凝集素的糖链专一性及其临床应用和方法。

4.0代树枝状分子-卟啉标记伴刀豆凝集素亲和吸附固体基质室温磷光法测定人血清中甲胎蛋白异质体

提出一种4.0代树枝状分子(4.0G-D)-卟啉(P)双发光分子新的磷光标记试剂(4.0G-D-P).基于4.0G-D-P标记伴刀豆凝集素(Con A)的产物(4.0G-D-P-Con A)能在聚酰胺素膜(PAM)上发射强而稳定的室温磷光(RTP),而且该标记产物能与甲胎蛋白异质体(AFP-V)发生特异性的亲和吸附(AA)反应,其反应产物保持了4.0G-D-P双发光分子RTP的优良特性,且ΔIp值与AFP-V的含量呈线性关系,加入Tween-80可以提高ΔIp值,据此建立了Tween-80-4.0G-D-P双发光分子标记Con A亲和吸附固体基质室温磷光法(AA-SS-RTP)测定人血清中AFP-V的新方法.直接法的检出限为0.31 pg/mL(4.0G-D)和0.43 pg/mL(P),灵敏度较高.无论用4.0G-D或P的激发/发射波长测定人血清中AFP-V的含量,结果与酶联免疫法(ELISA)相吻合.

重组含糖识别结构域的人源半乳糖凝集素-3在糖蛋白/糖肽富集中的应用

植物凝集素是广泛使用的糖蛋白富集和识别材料,动物凝集素则较少被尝试用于糖蛋白富集。基于人源半乳糖凝集素-3的糖识别结构域(CRD),设计了两种重组凝集素:Gal3C(一个CRD)和Tetra-Gal3C(四重串联CRD)。通过将两种凝集素固定于链霉亲和素琼脂糖小球上,构造了富集糖蛋白的重组凝集素亲和柱。使用凝胶电泳、免疫印迹以及生物质谱技术对重组凝集素的生物特征及其糖蛋白富集能力进行了表征与评价,发现两种类型的重组凝集素对糖蛋白/糖肽都有良好的富集效果,并具有较高的特异性和灵敏度。相对于Gal3C而言,TetraGal3C由于具有四重串联的CRD结构域,表现出更高的糖蛋白/糖肽富集能力。该凝集素亲和柱成功用于人肝癌细胞系HepG2的糖蛋白富集,表明重组凝集素具有从复杂生物样本中选择性识别和富集糖蛋白/糖肽的能力。

糖蛋白-凝集素自组装构筑有序膜及在酶电极的应用

利用糖蛋白-凝集素的识别作用交替沉积伴刀豆球蛋白(ConA)与辣根过氧化物酶(HRP)制备酶自组装多层膜,用原子力显微镜(AFM)观测了自组装膜的表面形貌、表面粗糙度;AFM和椭圆偏振研究测定了自组装膜的厚度.结果表明,ConA和HRP膜厚分别为9.0和4.6nm,与两者的晶体衍射结果一致,说明生物识别自组装方法能很好地保持分子的原有形态.以亚甲蓝(MB)溶液为介体,用循环伏安法测定了表面修饰了三层(ConA/HRP)自组装膜的金电极对H2O2的电化学催化还原作用,在H2O2浓度为0.2～1.0mmol·L-1时,响应电流对H2O2浓度变化成线性,酶电极灵敏度为24.0mA·mol-1·L,表观米氏常数为4.2mmol·L-1.

洋刀豆凝集素的灭活研究

洋刀豆蛋白是一种具有较高营养价值的植物蛋白质 ,但是其中含有的一些抗营养因子 ,如血球凝集素 (ConcanavalinA ,简称ConA)、胰蛋白酶抑制剂等 ,限制了它在人类食用植物蛋白和动物饲料中的应用 ,其中ConA是最主要的抗营养因子 .本文旨在研究洋刀豆植物蛋白中的ConA的灭活方法 .分别利用干热、湿热、酸碱和茶多酚处理法灭活ConA .实验表明 ,在保持洋刀豆蛋白质良好品质的条件下 ,干热处理不能使ConA的活力明显丧失 ;而 95℃、30min ,1 0 0℃、2 0min或 1 0 5℃、1 0min的湿热处理 ,可使ConA的活力完全丧失 ;在pH1 0～ 5 0或pH8 5～ 1 2 5范围内 ,提取洋刀豆蛋白质 ,可使ConA的活力显著丧失 ;洋刀豆蛋白液中茶多酚浓度达到 1 7 5g/L时 ,也可完全灭活ConA的活力 .

ConA识别的高甘露糖型糖蛋白在肿瘤患者血清中表达的研究

目的研究ConA识别的高甘露糖型糖蛋白在鼻咽癌、肺癌、肝癌和结直肠癌患者血清中的表达规律。方法应用ConA(刀豆凝集素)亲和层析法从正常人血清中获得ConA识别的高甘露糖型糖蛋白。结果ConA识别的高甘露糖型糖蛋白明显高于正常人和良性疾病患者,阳性率分别为77.4%,65.2%,70.3%;鼻咽癌患者血清阳性率为21.4%。且在结直肠癌患者有效治疗后该糖蛋白水平显著下降,阳性率也下降。结论血清中ConA识别的高甘露糖型糖蛋白,可用于肿瘤患者血清糖基化异常和肿瘤发病机理的研究,并可为临床诊断和治疗效果的评价提供参考指标。

中国明对虾乙酰基专一性凝集素分离纯化方法的研究

为研究凝集素在中国明对虾天然免疫中的作用，利用3种不同物质——N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、胎球蛋白（Fetuin）和小牛黏液素（BSM）为配基，分别与3种柱材料结合进行亲和层析，从中国明对虾血淋巴中纯化凝集素。这3种亲和层析均得到了一种相同的凝集素FCL-1，经SDS-PAGE证明FCL-1的分子量为168kDa。利用新鲜小鼠血细胞进行分离纯化同样获得了这种凝集素。FCL-1与乙酰基糖类和唾液酸类糖蛋白均具有较强的结合特性。

刀豆球蛋白A诱导的葡聚糖纳米凝胶高层级自组装

基于葡聚糖这类结构明确的水溶性多糖,以接枝聚合诱导自组装法(GISA)制备得到具有交联结构的葡聚糖纳米凝胶。在此基础上,利用刀豆球蛋白A(Con A)与葡聚糖中葡萄糖单元之间的特异性识别作用,诱导葡聚糖纳米凝胶的高层级自组装,从而制备尺度可控的Con A-葡聚糖纳米凝胶高层级自组装体。通过透射电镜、红外光谱、核磁共振光谱、等温滴定量热法等手段对高层级自组装体的粒径、结构和形貌进行表征,探讨了其高层级自组装的机理。此外,还探究了Con A以及Con A-葡聚糖纳米凝胶高层级自组装体对人肺癌细胞A549的细胞毒性。结果表明:该自组装体的尺寸同葡聚糖与Con A的质量比直接相关;游离的Con A对A549细胞具有抑制作用,且Con A在参与高层级自组装的过程中生物活性保持不变。

在传染病中胶原凝集素和其他猪先天免疫基因的单核苷酸多态性

许多不同的表面受体和可溶解的蛋白作用在先天免疫识别抗原与之结合、补体活化、吞噬作用以及适应性免疫之前。甘露聚糖结合凝集素（MBLs），纤维胶凝蛋白（FCNs）和表面活性蛋白-A（SP—A）都是可溶胶原凝集素，这些凝集素联接不同细菌、病毒和霉菌的表面结构蛋白。

联用“点击”化学及可逆加成-断裂链转移聚合构建树枝化含糖聚合物及其对刀豆蛋白A识别研究

通过梯度有机合成反应、联用“点击”化学反应(铜催化叠氮-炔环加成反应(CuAAC反应)和巯基-烯光化学反应(Thiol-ene反应)),采用“聚合后改性”策略对可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT聚合)制备的聚五氟苯基丙烯酸酯(pPFPA)进行聚合后改性,合成得到一系列侧链结构明确的树枝化甘露糖含糖聚合物,实现侧链链接基团的刚性、柔性可调节.系统研究侧链含有不同链接基团(刚性三唑环由CuAAC反应实现、柔性硫醚键由Thiol-ene反应实现)的树枝化含糖聚合物对刀豆蛋白A(Con A)的识别能力影响.等温滴定量热法(ITC)测试表明,与刚性三唑环相比,树枝化含糖聚合物侧链中含有柔性链接基团比例越高,含糖聚合物与Con A的结合能力越强.这可能是因为:一方面柔性链接基团可以在聚合物链上提供更多的空间来结合Con A;另一方面柔性链接基团在含糖聚合物对凝集素Con A识别中具有协同效应导致.

玉竹糖蛋白分离纯化及其体外抗氧化能力

采用磷酸缓冲液浸提法提取玉竹糖蛋白粗品(Polygonatum odoratum glycoprotein,PDG),经葡聚糖凝胶G-100和刀豆凝集素A分离纯化,得到糖蛋白组分PDG1和PDG3,经高效液相色谱测定其分子质量,并检测PDG、PDG1和PDG3的体外抗氧化活性。结果表明,PDG1和PDG3的分子质量分别为186 k D和28.3 k D;玉竹糖蛋白具有一定的还原能力,对羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基具有较强的清除作用,对脂质过氧化具有抑制作用,且在一定质量浓度范围内(1~10 mg/m L)存在剂量关系,其抗氧化能力随着玉竹糖蛋白质量浓度的增加而增强,PDG1和PDG3的抗氧化能力优于PDG。

人MBL糖识别域在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

目的原核表达重组人甘露聚糖结合凝集素(MBL)糖识别域(CRD)。方法采用PCR技术,从含汉族人MBL全长编码区cDNA的重组质粒pGEMmbl中扩增出CRD包括颈区的基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T1中,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以GSTtrap亲和层析柱纯化,融合蛋白经凝血酶切割后回收目的蛋白。分别以Westernblot和ELISA分析表达产物的免疫学和糖结合活性。结果PCR扩增得到长约450bp的目的基因片段,插入pGEX4T1载体所获重组表达载体pGEX4T1CRD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在。以GSTtrap亲和层析柱纯化获得约Mr43000的GSTCRD融合蛋白,经凝血酶切割后得到约Mr17000的CRD蛋白。纯化的GSTCRD蛋白能与抗人CRD单克隆抗体特异性结合并具糖结合活性。结论获得了具生物学活性的人MBLCRD蛋白,为进一步探索MBL分子CRD的效应功能提供了实验材料。

人健康肝组织刀豆凝集素(Con A)结合型糖蛋白组学研究

通过凝集素亲和层析技术结合双向电泳-质谱技术构建人健康肝组织Con A结合型糖蛋白数据库并进行生物信息学分析;利用研磨和匀浆两步法抽提人健康肝组织总蛋白,通过固相凝集素亲和层析获得与刀豆凝集素(Con A)结合型糖蛋白,经过双向电泳、荧光染色、图像分析获得人健康肝组织表达谱;通过MALDI-TOF-MS质谱鉴定及生物信息学分析获得人健康肝组织数据库,并建立了高重复性的人健康肝组织Con A结合型糖蛋白表达谱,图谱均点数为301±15,挖取139个蛋白点进行质谱鉴定,去冗余后确定了85个与细胞周期、代谢通路相关的蛋白质;通过NetNGlyc和NetOGlyc对糖基化位点进行预测,并按照geneontology对其功能定位等进行分类,并对其中与肿瘤发生发展相关的蛋白进行具体分析.由此可见,凝集素亲和层析结合2-DE,质谱鉴定是一种高通量的检测方法,Con A结合型糖基化修饰谱的构建为后续研究奠定了基础.

胆汁刀豆凝集素A结合蛋白在胆固醇结石早期形成阶段的作用

应用快速蛋白液相色谱分子筛与离子交换技术结合另一亲和层析系统——蜗牛凝集索(HP),对胆汁主要成核效应蛋白系统——刀豆凝集索A(ConA)结合蛋白的成核活性进行系统研究,得到一种抑成核的60KD蛋白与一种130KD的促成核蛋白。借助减法试验,对分离获得的这两种蛋白的成核重要性作了评估,为进一步寻找更重要的成核效应蛋白提供了又一途径。

缺氧缺糖后再给氧给糖对培养心肌细胞膜糖蛋白变化的影响

本实验应用凝集素伴刀豆球蛋白Ａ（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ，ＣｏｎＡ）为探针，以能量制剂ＭｇＡＴＰ、氧自由基清除剂ＳＯＤ及钙阻滞剂异搏定作用于体外缺氧缺糖培养后再给氧给糖，观察对大鼠乳鼠培养心肌细胞的影响。发现心肌细胞膜、肌质网膜、线粒体膜等生物膜上存在ＣｏｎＡ受体；缺氧缺糖后再给氧给糖组心肌细胞生物膜上致密阳性产物减少，而用药组不减少，与正常组相近，对照组则无这种阳性产物。提示，尽管这种变化机制尚不大清楚，但与糖蛋白合成、加工、运输和分泌的细胞的结构和功能变化有关。

沙棘总黄酮对淋巴细胞增殖和白细胞介素产生的影响

沙棘总黄酮(TFH)低浓度增强ConA、PHA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖和PHA诱导人外周血淋巴细胞增殖,高浓度则产生抑制;对IL-2的产生亦具有相似的作用,低浓度促进、高浓度抑制;对IL-1的产生则表现为明显增强作用。但在无丝裂原刺激的条件下,TFH对人和小鼠淋巴细胞增殖无明显影响。

37Glu突变型MBL蛋白在CHO细胞中的表达及其生物学特性研究

目的:探索甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因GGA57GAA点突变引起免疫缺损的机制。方法:采用PCR从质粒pMBLm57中扩增含GGA57GAA点突变的MBL基因,构建重组真核表达载体,电转染CHO细胞,以Zeocin筛选并克隆化培养,用mAb-Sepharose 4B和Ni2+-NTA agarose层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot、ELISA、配体结合试验、C4d沉积试验等鉴定目的蛋白。结果:重组真核表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞后获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株;37Glu突变型MBL蛋白主要以双链(Mr约60000)存在,不能形成高聚体;其配体结合能力低下,与MASP-2N端蛋白的结合能力也降低,不能通过凝集素途径激活补体系统。结论:GGA57GAA点突变产生结构有缺陷的MBL蛋白,进而影响其识别功能和效应功能。

人CLEC-2胞外段CRD重组蛋白纯化与多克隆抗体的制备和活性鉴定

人C型凝集素样受体(human C-type lectin-like receptor-2,hCLEC-2)是新克隆的Ⅱ型跨膜受体分子,研究表明,它在病毒感染,血小板活化、聚集,肿瘤转移和信号转导等方面发挥重要作用.通过制备针对其胞外段糖类识别结构域(CRD)的抗体来进一步研究该蛋白质的生物学功能及相关信号通路.构建了pET23b-CRD重组表达质粒,将其转化到大肠杆菌BL21中,用于hCLEC-2-CRD-His融合蛋白的表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明,融合重组蛋白成功获得了高效表达,分子质量在18ku左右.经鉴定,发现hCLEC-2-CRD-His表达于包涵体中.为获得高纯度的可溶性蛋白,将包涵体溶于6mol/L盐酸胍,并用镍柱进行纯化.纯化后的蛋白质经过透析、再折叠后作为抗原,免疫家兔制备抗血清,抗血清经蛋白G亲合层析纯化后用Western blot等方法进行鉴定,结果显示该抗体能特异性地检测到GFP-hCLEC-2和GFP-CRD.通过使用该抗体,进一步发现,在用PMA和IL-4诱导单核细胞THP-1分化的过程中,内源性hCLEC-2蛋白水平下调,初步揭示了hCLEC-2的表达和单核细胞的分化存在一定的联系.因此,该抗体的成功制备将为进一步研究CLEC-2的生物学功能提供有利的条件.