中国恒河猴DNGR-1分子C型凝集素样结构域在大肠杆菌系统表达

目的获得恒河猴C型凝集素结构域家族9的A成员(Clec9A)基因编码区序列;体外表达CLEC9A的C型凝集素样结构域(CTLD)。方法利用Clec9A基因特异引物,反转录PCR扩增中国恒河猴Clec9A基因编码区,亚克隆至pGEM-T载体,获得pGEM-T-DNGR质粒并进行测序。构建CLEC9A分子的CTLD区原核表达质粒pET-32a-CTLD,转化BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并用SDS-PAGE和Western blot法对目的蛋白进行鉴定。结果 PCR扩增得到726 bp的Clec9A编码区全长,测序和序列比对发现恒河猴CLEC9A编码区的核苷酸序列与人和小鼠的同源性分别为95.0%和73.1%,推测的氨基酸同源性分别为91.7%和57.3%。体外表达获得相对分子质量(Mr)约32 000的CTLD融合蛋白,Western blot方法鉴定发现其与人DNGR-1分子具有相似的抗原性。结论中国恒河猴Clec9A基因与人的高度相似并能编码与人CTLD抗原性相似的蛋白。

P-选择素凝集素样结构域和红色荧光蛋白融合基因的构建

目的 构建P 选择素凝集素样结构域与红色荧光蛋白融合基因 (pDsRed1 N1/L) ,以进一步明确P 选择素不同表位与功能间的关系 ,为阐明P 选择素生理病理意义奠定基础。方法 应用PCR技术扩增质粒 pCDM1/cDNA凝集素样区 ,用T4连接酶将其插入载体pDsRed1 N1;经酶切和测序对插入片段进行分析、鉴定。结果 通过酶切和序列分析确定重 ,组pDsRed1/N1的片段为目的基因的核苷酸序列。 结论 应用基因工程技术构建 pDsRed1 N1/L融合基因成功 ,为红色荧光蛋白作为生物标记分子来研究P 选择素分子的构效关系打下基础。

TNF凝集素样结构域:高原肺水肿药物治疗新选择

高原肺水肿是高原地区人群常见的高原疾病之一,严重威胁着人们的生命健康。它的发病机制目前尚未完全清楚,主要与驱动水进入肺泡的力量和清除肺泡液的能力两者失衡有关。目前用于治疗高原肺水肿的药物大多作用机制不明且不良反应较多。而TNF凝集素样结构域一方面能直接激活Ⅱ型肺泡上皮顶端钠通道,加速水肿肺的肺泡液清除;另一方面还具有抗炎作用,能减慢肺水肿的形成,是高原肺水肿药物治疗的一种新选择。

C-型凝集素样结构域1对特发性膜性肾病预后影响的单中心研究

目的通过检测特发性膜性肾病(IMN)患者血清C-型凝集素样结构域1(CTLD1)的水平,探讨CTLD1对IMN预后影响的临床意义。方法选取2016年9月至2019年12月盛京医院住院诊断为IMN的患者116例作为病例组,选取同期体检中心年龄、性别匹配的健康志愿者作为健康对照组。收集病例组患者的临床资料,随访≥2年记录治疗与转归。ELISA法测血清抗M型磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体水平及CTLD1抗原表位表达水平,比较CTLD1阳性组、阴性组之间临床指标的差异;分析影响IMN患者预后的因素。结果健康对照组与病例组CTLD1表位表达差异有统计学意义(P<0.01)。CTLD1阳性组血补体3(C3)水平(Z=2.402,P=0.016)、抗PLA2R抗体水平(Z=2.266,P=0.023)高于CTLD1阴性组;CTLD1与血C3(r=0.239,P=0.012)和抗PLA2R抗体(r=0.233,P=0.016)分别存在正相关关系。Cox回归分析提示,CTLD1水平高是疾病缓解的不利因素(HR=0.733,P<0.05),CTLD1阳性预示着预后不良(HR=0.628,P<0.05)。结论CTLD1表位表达水平与PLA2R相关性IMN患者的预后相关,CTLD1对其病情评估及预后判断有一定的临床意义。

人P选择素胞外区Lectin-EGF片段的基因克隆及表达研究

目的 构建表达人P -选择素胞外凝集素 -表皮生长因子样区 (Lectin -EGF)片段的基因工程菌。方法 从人血小板中提取总RNA ,经RT -PCR得到P -选择素cDNA ,用PCR方法扩增其中的Lectin -EGF片段 ,并将其克隆到原核表达载体PBV2 2 0中 ,再转化宿主菌DH5α。结果 通过酶切、PCR和基因序列分析确定重组载体片段为目的基因的核苷酸序列 ,并在大肠杆菌中获有效表达重组蛋白。结论 表达人P -选择素胞外区Lectin -EGF片段的基因工程菌的成功构建 。

基于Gal-3/NLRP3/IL-1β信号通路探讨异荭草苷治疗溃疡性结肠炎的作用机制

目的探讨异荭草苷对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)小鼠的治疗效果及其作用机制。方法将48只C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组(600 mg·kg^(-1))、异荭草苷低剂量组(25 mg·kg^(-1))、异荭草苷高剂量组(50 mg·kg^(-1))及异荭草苷对照组(50 mg·kg^(-1)),每组8只。小鼠自由饮用2%DSS溶液复制UC模型,实验进行3周后,各给药组给予相应药物灌胃治疗4周。给药结束后,称取体质量,摘眼球取血,剖取结肠组织。采用苏木素-伊红(HE)、阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色(AB-PAS)法观察小鼠结肠组织病理形态变化;透射电子显微镜观察小鼠结肠组织超微结构;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、脂多糖(LPS)和髓过氧化物酶(MPO)水平;免疫组化法检测小鼠结肠组织中半乳糖凝集素(Gal-3)蛋白表达;免疫荧光法检测黏蛋白(MUC2)表达及NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)共定位情况;免疫印迹(Western Blot)法检测小鼠结肠组织中Gal-3、NLRP3、ASC、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、IL-1β、IL-18、闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白1(ZO-1)蛋白表达。结果与正常组比较,模型组小鼠体质量明显下降,结肠长度明显缩短,肠质量指数明显增加(P<0.01);小鼠肠黏膜结构紊乱,微绒毛稀疏,隐窝结构见大量炎性细胞浸润,线粒体肿胀明显,杯状细胞明显减少;血清IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、LPS和MPO水平明显升高,IL-10水平明显降低(P<0.01);结肠组织MUC2蛋白阳性表达减少及NLRP3和ASC共定位增强;结肠组织中Gal-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达明显增加,Occludin和ZO-1蛋白表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较,异荭草苷低、高剂量组小鼠体质量明显上升,结肠长度明显增长,肠质量指数明显降低(P<0.05,P<0.01);肠黏膜、微绒毛及线粒体结构明显恢复,炎性浸润减轻,杯状细胞明显增加;血清IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、LPS和MPO水平明显降低,IL-10水平明显升高(P<0.05,P<0.01);结肠组织MUC2蛋白阳性表达增加,NLRP3和ASC共定位减弱;结肠组织中Gal-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达明显降低,Occludin和ZO-1蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01)。结论异荭草苷对DSS诱导的UC小鼠具有良好的治疗效果,其机制可能与抑制Gal-3/NLRP3/IL-1β信号通路,保护肠黏膜屏障有关。