应用凝集素芯片检测肝癌细胞膜表面糖链变化

利用凝集素糖链特异亲和原理构建对细胞膜表面糖链进行即时检测的凝集素芯片体系,检测肝癌发生过程中细胞膜糖链的变化.从H22细胞系、正常小鼠和肝癌模型鼠肝组织中提取细胞进行荧光标记,激光扫描仪检测凝集素位点捕获的细胞,根据凝集素特异亲和性确定细胞膜表面糖表达谱,显微镜下观察捕获细胞的形态.对凝集素芯片捕获细胞的最佳条件进行探讨,用甘露糖抑制试验、流式细胞仪和不同血型红细胞验证了凝集素捕获细胞的特异性.结果显示:正常和肝癌小鼠肝细胞膜表面糖链存在较大差异,正常组只有PSA、DSL、STL、NPL凝集素位点捕获到细胞,实验组只有LTL和DBA位点没有捕获到细胞,提示小鼠肝癌组织细胞膜表面糖链显著增加,细胞膜上唾液酸、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、甘露糖和半乳糖糖链表达增加,这些糖链及其相关糖蛋白可能在肝癌的发生和发展中起一定作用.该凝集素芯片有较好的稳定性和特异性,可以对细胞膜表面糖链进行动态、即时、通量的检测,为研究细胞膜表面聚糖在细胞发育和癌变等过程中的变化提供了一个技术平台.

基于凝集素芯片的不同转移潜能肝癌细胞膜蛋白糖谱比较

评估采用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面侵袭和转移相关特征性糖谱的适用性.首先选取一对模式细胞株(中华仓鼠卵巢细胞CHO和其N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ缺陷株Lec1)验证凝集素芯片系统的可靠性.然后通过凝集素芯片比较正常肝细胞L02、非转移肝癌细胞Hep3B、高转移肝癌细胞HCCLM3的细胞表面糖谱,同时采用细胞凝集素组织化学的方法验证芯片结果.细胞Hep3B和L02相比,对凝集素PHA-L、ConA、AAL、MPL的亲和作用增强而对凝集素WGA的亲和作用减弱,提示在肝癌细胞表面可能出现了增多的复杂寡糖分支、高甘露糖、末端岩藻糖、黏蛋白T抗原和减少的N-乙酰葡萄糖胺和/或多价唾液酸结构.细胞HCCLM3和Hep3B相比,对凝集素LCA、MAL-Ⅰ、MAL-Ⅱ、WGA、PHA-E的亲和作用增强而对凝集素RCA-I的亲和作用减弱,提示在高转移肝癌细胞HCCLM3的表面可能出现了增多的核心岩藻糖、唾液酸(主要是α2-3链接方式)、N-乙酰葡萄糖胺、平分型GlcNAc结构以及减少的末端β1-4链接半乳糖结构.细胞凝集素组织化学的结果支持芯片结果.研究证明,凝集素芯片技术是解析生物学进程中糖谱改变的适用工具.

凝集素芯片技术检测糖蛋白方法的建立及初步应用

建立了凝集素芯片技术检测糖蛋白的方法,对实验条件进行了优化,应用凝集素芯片初步检测分析了Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成.将凝集素ConA、GNA固定于环氧化修饰的玻片表面,用Cy3标记标准糖蛋白RNaseB,利用凝集素识别特异糖链的原理建立凝集素芯片检测糖蛋白的方法.摸索出最佳封闭剂是含1%BSA的磷酸缓冲液,最佳孵育时间及温度为3h和室温,最佳孵育缓冲液为含1%BSA和0.05%Tween-20的磷酸缓冲液,并用甘露糖抑制实验验证了凝集素芯片结合的特异性.用包含10种凝集素的芯片,成功解析了标准糖蛋白RNaseB、Fetuin的糖链构成,证实了凝集素芯片检测糖蛋白糖链的可行性.最后用凝集素芯片初步检测分析了Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成,发现Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白可能有多价Sia或GlcNAc、terminalα-1,3 mannose、GalNAc、Galβ-1,4GlcNAc这些糖链结构的存在.蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,它在微生物感染、细胞分化、肿瘤转移、细胞癌变等生命活动中起着重要作用,因此近年来蛋白质的糖基化研究受到广泛的重视,但由于缺乏一种简便、快速、高通量的检测手段,蛋白质糖基化修饰的研究发展缓慢.凝集素芯片技术的出现实现了对糖蛋白的快速、准确、高通量的检测分析.

构建金纳米粒子标记的凝集素芯片应用于抗生素与金黄色葡萄球菌相互作用研究

建立了一种基于凝集素芯片的共振光散射(Resonance light scattering,RLS)法,用于研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)与3种广谱抗生素(阿莫西林、万古霉素和链霉素)间的相互作用。本方法通过固定于基片表面的凝集素捕获细菌,使用西非单叶豆凝集素II(Griffonia simplicifolia II,GSⅡ)修饰的38.5 nm金纳米粒子(GNP@GSⅡ)标记捕获的S. aureus获取RLS信号。考察了抗生素存在下S. aureus与16种凝集素亲和能力的变化,发现阿莫西林和万古霉素能够显著降低S. aureus表面糖基化合物的表达种类和表达量;链霉素则能够提高S. aureus表面糖基化合物的表达水平。另外,根据凝集素与S. aureus的特异性识别图谱以及GSⅡ子阵列对S. aureus捕获量变化,能够获得不同抗生素对S. aureus的最小抑制浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和杀菌效率。

应用凝集素芯片分析癌细胞膜表面糖链表达

细胞膜表面糖复合物的糖链结构与肿瘤细胞增殖、侵染、转移等发展过程密切相关.凝集素芯片技术的出现实现了对癌症的糖组进行快速、高通量的检测.通过模式细胞系PANC-1证明了构建的凝集素芯片体系的准确性、重复性、特异性,应用这一芯片体系初步检测了几种癌细胞系(HT-29、SGC-7901、BEL-7402、H460)的膜表面糖链表达.这几种癌细胞系表面都有唾液酸、乙酰葡萄糖/葡萄糖、乙酰半乳糖/半乳糖、甘露糖等糖链.根据实验结果,推测它们的细胞膜表面α1-6岩藻糖链表达水平可能较高,而α1-3岩藻糖链表达水平较低;这些聚糖可能是癌症潜在的标志物.凝集素芯片有助于推动癌细胞膜表面糖链的快速分析和筛选出癌症相关的糖链标志物.

应用凝集素芯片检测胃正常黏膜上皮细胞与胃癌细胞膜表面糖链表达

目的应用凝集素芯片检测胃正常黏膜上皮细胞系GES-1和胃癌细胞系SGC7901、MKN45细胞膜表面糖链表达,并对芯片上捕获的细胞进行初步的免疫荧光研究。方法用胶原酶Ⅱ消化细胞系,利用芯片上的凝集素位点对糖链的亲和特异性捕获荧光标记的细胞,激光共聚焦扫描仪扫描检测细胞膜表面糖链表达。结果在大多数凝集素位点上,这几种细胞均显示出荧光信号;在凝集素位点WBA、EEL、MAH-Ⅱ上均未显示荧光信号;其中,与GES-1相比,胃癌细胞系SGC7901和MKN45在LTL、HHL位点上基本没有荧光信号。结论根据凝集素的亲和特异性说明,这几种细胞系膜表面共同表达的糖链包括:唾液酸、乙酰葡萄糖/葡萄糖、乙酰半乳糖/半乳糖、甘露糖等糖链。其中,胃癌细胞系SGC7901和MKN45可能较少表达岩藻糖。

应用凝集素芯片检测非小细胞肺癌细胞膜表面糖链表达

目的应用凝集素芯片检测非小细胞肺癌细胞系A549和H460细胞膜表面糖链表达类型。方法用胶原酶Ⅱ消化非小细胞肺癌细胞系,对提取的细胞进行荧光标记,利用凝集素对糖链的特异亲和性捕获细胞,激光扫描仪检测细胞膜表面糖链表达。结果腺癌A549和大细胞肺癌H460除LTL和DBA这两个凝集素位点没有捕获到细胞外,其余各点均捕获到细胞。结论根据凝集素的亲和特异性表明,非小细胞肺癌细胞膜表面糖链类型主要有:唾液酸、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、甘露糖和半乳糖糖链,为建立癌症细胞膜表面糖链表达谱和寻找肺癌分子靶向治疗的药物作用位点提供理论依据。

凝集素芯片法分析桥本氏甲状腺炎患者外周血DC细胞膜糖蛋白的表达

目的通过凝集素芯片法筛选桥本氏甲状腺炎(HT)患者外周血树突状细胞(DC)差异表达的膜表面糖蛋白,了解其在HT中的表达变化。方法通过制备包含有32种凝集素的凝集素芯片对16例HT患者和22例健康者外周血DC细胞膜表面糖蛋白的表达进行分析;凝集素耦联葡聚糖拉下相应差异表达的糖蛋白并进行质谱鉴定;同时应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot法和流式细胞术对HT患者外周血DC中该糖蛋白的mRNA、蛋白表达及Galectin-9+DC比例进行分析。最后通过ELISA法检测DC与CD8+T细胞孵育上清液中IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B浓度。结果凝集素芯片检测结果显示凝集素脱落酸素(ABA)对应的糖蛋白在HT组显著低于健康组(P<0.01)。对凝集素ABA耦联葡聚糖拉下后洗脱的蛋白进行质谱鉴定,结果显示,众多洗脱蛋白中半乳糖结合蛋白-9(Galectin-9)所占比例较为丰富;随后通过qRT-PCR和Western blot进一步验证Galectin-9在HT组DC中的表达低于健康组;流式细胞术结果则显示HT组DC Galectin-9low比例高于健康组,且其均能较健康组诱导CD8+T细胞产生3种高水平杀伤因子。结论HT患者外周血Galectin-9lowDC可能与HT相关。

凝集素芯片对体液细胞进行检测方法的建立和初步应用

建立对体液细胞进行自动捕获的凝集素芯片体系,利用凝集素对糖链的特异亲和作用捕获细胞,提取白血病患者外周血、肺癌胸水和肝腹水中细胞进行荧光标记,凝集素芯片捕获,激光扫描仪检测捕获细胞的荧光信号,常规HE染色后光学显微镜下观察细胞的形态并进行免疫化学反应,流式细胞仪验证凝集素芯片的特异性.结果表明:凝集素芯片可以对体液中的癌细胞进行自动捕获,对癌细胞膜表面糖链进行识别,芯片检测的细胞浓度最少可达每mL 104个左右,芯片有较好的重复性和特异性.这种凝集素芯片可用于临床体液中癌细胞的检测分析,对癌细胞膜表面凝集素亲和位点进行即时、高通量的检测,为了解细胞膜表面聚糖在癌变过程中的变化提供了一个技术平台.

凝集素芯片技术在常见妇科肿瘤诊断中的应用

目的探讨人血清糖蛋白的糖链结构信息在常见妇科肿瘤临床诊断中的价值。方法收集123例临床血清样本,其中乳腺癌31例、宫颈癌24例、卵巢癌19例、健康女性体检者49例,通过自制的包含15种不同凝集素的凝集素芯片来测定人血清中糖蛋白的糖链结构信息,利用SPSS 15.0统计软件进行分析,采用逐步判别分析法建立关于样本分组的判别函数方程。结果首先建立用于区分健康者与肿瘤患者的判别函数方程,对健康样本和肿瘤样本的回判正确率分别为85.7%、83.8%,总的判别正确率为84.6%;然后针对肿瘤组再建立用于区分乳腺癌、宫颈癌和卵巢癌的判别函数方程,结果对乳腺癌、宫颈癌和卵巢癌的回判正确率分别为96.8%、75.0%、78.9%,总的判别正确率为85.1%。结论人血清糖蛋白的糖链结构信息与妇科肿瘤存在相关性,基于凝集素芯片检测结果建立的判别函数方程对于临床血清样本的诊断判别具有一定的参考价值。

利用凝集素芯片检测多囊肾病特异iPS细胞表面糖谱的研究

目的:建立一套凝集素芯片检测活体iPS细胞表面糖谱的方法。方法:以ADPKD-iPS为对象,运用不同活细胞染料,尝试不同的染色时间,找到最佳的iPS细胞与凝集素芯片结合的实验方案。结果:利用SYBR green,染色30min可以获得最佳的信号强度和信噪比。结论:已成功建立了一套利用凝集素芯片对活体iPS细胞进行表面糖谱检测的方法。

凝集素芯片的研究现状

继基因组和蛋白质组之后,以研究信息的第三类大分子——糖复合物上的聚糖的结构和功能为主要内容的糖组学,引起越来越多的关注。凝集素,作为一种研究聚糖结构的重要工具,由于其高度的特异性,在糖组学研究中正发挥着越来越重要的作用。本文主要对近几年发展起来的凝集素芯片的研究现状进行了阐述。

应用凝集素芯片检测系统性红斑狼疮红细胞膜表面糖链变化

应用凝集素芯片检测系统性红斑狼疮患者红细胞膜表面糖链表达类型。分别取患者和健康人血液作为实验组和对照组,用低渗液处理红细胞使其破碎,离心制备血影,利用凝集素芯片特异亲和性捕获血影表面糖链,激光扫描仪检测凝集素信号,根据凝集素特异性得到细胞膜表面糖链表达变化。结果表明实验组在凝集素位点ECA、WFA、SBA、UEA-Ⅰ呈现阳性(p<0.01)且在ConA、PTL-Ⅰ、DBA等凝集素位点信号值上调,在STL、SJA、LCA、GSL-Ⅰ、LEL凝集素位点信号值下调(p<0.05)。根据凝集素亲和特异性显示,系统性红斑狼疮患者红细胞膜表面Gal、GlcNAc、Fuc等糖链结构表达均增加。为系统性红斑狼疮的研究增添理论依据。

基于凝集素芯片的蛋白质糖基化修饰检测方法

目的：建立针对组织和血清样本中蛋白质糖基化的凝集素芯片检测方法 ,并结合凝集素印迹法验证,以实现样品间糖基化修饰差异的高通量筛选。方法：采用包含91种凝集素的凝集素芯片,利用生物素标记的组织总蛋白质样品,比较实验的重复性及不同上样量的芯片实验效果。利用生物素标记的去高丰度蛋白质血清和全血清样品,比较两者芯片实验的检出情况及全血清样品不同上样量的芯片实验效果。以最优条件筛选癌组织与癌旁组织样品之间及不同疾病患者血清样品之间的糖基化修饰差异,采用凝集素印迹法验证凝集素芯片实验结果。结果：芯片重复性良好（r〉0.94）,组织样品在0.625-1.250μg/m L时实验效果较佳;去高丰度蛋白质血清和全血清样品以高浓度上样时（≥20μg/m L）,两者检出相近。标记后的全血清样品取2μL稀释至150μL时,实验效果最佳。筛选出检测信号有差异的凝集素经凝集素印迹法验证,结果与芯片检测一致。结论：该凝集素芯片实验体系稳定、可靠,可用于筛选临床样本间的糖基化修饰差异,有助于发现疾病相关的糖蛋白生物标志物。

凝集素芯片在糖链结构变化检测中的应用

细胞表面的糖蛋白及糖脂在许多生物学过程中均发挥着重要作用,如免疫保护、细胞通讯、炎症产生等。近年研究发现糖基化的改变与许多疾病如肿瘤的发生发展及转移密切相关。凝集素是一类能够与糖链结构特异性结合而又不具有糖链合成、转移和催化活性,且非免疫来源的蛋白质,已被广泛的应用于糖免疫学研究。凝集素芯片可快速、高通量分析生物样本糖构型,是一种检测细胞表面糖链整体变化的通用平台。本文对凝集素芯片的基本概念、技术发展及其在检测细胞表面糖谱和临床样本分析等方面的应用进行综述,并对其今后的发展方向进行展望。

应用凝集素芯片检测胃癌细胞膜表面糖链表达

目的:应用凝集素芯片检测胃癌细胞株AGS和SGC-7901细胞膜表面糖链表达,并分析差异糖链与胃癌侵袭转移的相关性。方法:用胰酶消化收集细胞,加入荧光标记试剂对细胞进行荧光标记,利用凝集素芯片上的凝集素位点对糖链的亲和特异性捕获荧光标记的细胞,激光共聚焦扫描仪检测,凝集素流式细胞术验证,进而通过Transwell和划痕修复实验比较细胞侵袭转移能力。结果:在大多数凝集素位点上,AGS和SGC-7901这两种细胞荧光信号未出现明显差异。与SGC-7901细胞相比,AGS细胞显示出较强的LEL和MALⅡ信号。甘露糖、唾液酸、乙酰葡萄糖/葡萄糖、乙酰半乳糖/半乳糖在两种细胞中均有表达。AGS细胞含有较多的多聚乳糖胺和α2-3唾液酸,且AGS细胞侵袭转移能力要强于SGC-7901细胞。结论:高侵袭转移潜能的胃癌细胞表达特征性的多聚乳糖胺和α2-3唾液酸。基于凝集素芯片进行细胞膜糖图谱检测,将有助于筛选出肿瘤相关的糖链标志物和肿瘤诊断治疗。

非转移性和转移性人肝癌血清糖蛋白凝集素亲和谱的比较研究

目的应用凝集素亲和技术寻找肝癌转移相关特征性血清糖蛋白凝集素亲和谱,并探讨其生物学意义。方法本研究利用含有13种肿瘤相关的凝集素集合芯片技术,比较研究了非转移性和转移性人肝癌血清糖蛋白凝集素亲和谱,同时采用多重凝集素印迹方法验证凝集素芯片结果。计量资料数据采用双样本异方差t检验,进行两两比较。结果研究证明,与非转移人肝癌血清相比,转移性肝癌血清糖蛋白对麦胚凝集素(wheatgerm agglutinin,WGA)、黑接骨木凝集素(sambucus nigra lection,SNA)、红腰豆凝集素(phaseolus vulgariserythroagglutinin,PHAE)和欧曼陀罗凝集素(datura stramonium lectin,DSA)的亲和作用增强(P<0.05)。提示转移性肝癌血清糖蛋白出现了增多的唾液酸(sialic acid,sia)、N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine,GlcNAc)、平分型GlcNAc及多天线、偏二天线糖链结构。结论血清糖蛋白聚糖链的变化与肿瘤侵袭和转移密切相关,为临床筛选肝癌侵袭及转移相关的糖标记提供了重要参考。

hCAFs的原代培养及其分泌蛋白聚糖谱探究

目的:研究人肝癌相关成纤维细胞(hCAFs)的原代培养及其分泌蛋白聚糖谱。方法:组织块贴壁法与酶消化联合组织块贴壁法进行hCAFs和正常成纤维细胞(NFs)的原代培养,观察两种方法对组织周围爬出细胞天数的影响;差速消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法(western blotting)、间接免疫荧光结合形态学观察对成纤维细胞进行鉴定;利用凝集素芯片检测hCAFs和NFs分泌蛋白聚糖谱。结果:与组织块贴壁法相比,酶消化法联合组织块贴壁法细胞爬出天数减少(P<0.01);经纯化后hCAFs的胞体较大,胞体突起较多,而NFs胞体较小,胞体突起较少;两种成纤维细胞中均有FSP、FAP、α-SMA、Vimentin蛋白和mRNA的表达,而在hCAFs中表达较高(P<0.05)。hCAFs的分泌蛋白对CALSEPA、JAC、MPL、SSA、STL等5种凝集素的亲和性增强,而对IRA、IAA、PSA、CSA、GSL-IA4的亲和性减弱。结论:酶消化联合组织块贴壁法可加速细胞爬出,更适于原代培养成纤维细胞;通过比较hCAFs和NFs的分泌蛋白聚糖谱,提示T/Tn抗原、唾液酸、N-乙酰氨基葡萄糖结构在hCAFs的分泌蛋白中增加;而N-乙酰半乳糖胺和α-甘露糖的结构减少。

肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化

目的应用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面转移相关的特征性糖谱。方法应用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导建立肝癌上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)细胞模型。通过凝集素芯片比较诱导前后细胞膜的糖谱改变,采用凝集素印迹和荧光细胞凝集素免疫组化方法验证芯片结果。结果诱导后细胞对凝集素ACL、BPL、JAC、MPL、PHA-E、SBA和SNA的亲和作用减弱,而对凝集素AAL、ConA、DBA、GSLⅡ、ECL、HAL、LCA、LTL、NML、NPL、PHA-L、PTLⅡ和WFL的亲和作用增强。提示诱导后肝癌细胞表面出现了黏蛋白T/Tn抗原、平分型N-乙酰葡萄糖胺、α2,6唾液酸和末端α或β连接的N-乙酰半乳糖胺结构减少;而末端和核心岩藻糖、高甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺β1,6分支和复杂型寡糖分支结构增多。结论肝癌细胞发生EMT过程中细胞膜表面糖链结构改变,提示糖链结构与肝癌的转移密切相关,为有效控制肝癌转移、改善预后提供了新思路。

生姜糖蛋白提取工艺优化及抗氧化活性研究

以生姜为原料,在单因素实验基础上采用三元二次回归正交组合设计优化生姜糖蛋白的提取工艺,采用红外光谱初步分析了生姜糖蛋白的结构特征。同时,考察了生姜糖蛋白的抗氧化活性和凝集素芯片的荧光强度。结果表明,生姜糖蛋白的最优提取条件:提取温度为90℃,液固比为35.5∶1,p H为7.5,在此条件下提取3 h,蛋白质得率为2.437 mg/g,糖得率为117.126 mg/g;经分离纯化获得的生姜糖蛋白,采用红外光谱分析表明其存在多糖和蛋白质的特征吸收峰。抗氧化实验与凝集素芯片实验结果表明,生姜糖蛋白在蛋白表面具有糖链结构,且可以螯和金属离子,具备一定的还原能力与重要的生理功能。