飞蝗几丁质合成酶2基因的表达特性、功能及调控

【目的】几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一,由于高等动物不存在该酶,而被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。论文在已克隆得到飞蝗几丁质合成酶2基因cDNA序列(LmCHS2,GenBank登录号:GU067731)的基础上,进一步深入探讨该基因在不同发育时期的表达特性、功能及调控,为基于RNA干扰技术的飞蝗有效控制提供科学依据。【方法】根据已知LmCHS2基因核苷酸序列,设计特异性表达引物,运用RT—qPCR技术研究该基因在卵、若虫及成虫期的表达特性;体外合成LmCHS2的dsRNA后,分别注射至成虫期第1天的雌虫和雄虫,收集第5天的中肠样本提取RNA,反转录成cDNA后,采用RT—qPCR方法检测LmCHS2沉默效果。解剖飞蝗整个肠道后,观察中肠的形态变化及围食膜的完整性,探讨该基因在成虫期的生物学功能;饥饿处理飞蝗不同时间后,再重新进食,观察试虫肠道的变化,进一步运用RT—qPCR技术检测LmCHS2的表达。【结果】LmCHS2在飞蝗卵发育的前期和中期几乎没有可检测到的表达,卵发育后期表达量急剧上升,在4龄、5龄若虫和成虫期稳定表达;分别对羽化后第1天的雌、雄成虫注射dsCHS2,与对照组相比,处理组试虫LmCHS2表达量均显著下降,且取食量明显减少,雌虫和雄虫死亡率分别达78%和85%;解剖消化道后发现,注射dsCHS2后飞蝗中肠几乎不含有食物,中肠和胃盲囊长度显著缩短;对中肠的组织学观察结果表明对照组飞蝗围食膜发育完整,而注射dsCHS2后围食膜被严重破坏甚至缺失;饥饿处理飞蝗48 h后,与对照组相比,饥饿组中肠几乎不合有食物,长度亦显著缩短。H&E染色结果表明,饥饿组围食膜被严重破坏,对照组围食膜结构完整,与RNAi的结果非常相似;重新进食后围食膜发育良好;饥饿处理24 h和48 h后LmCHS2的表达被显著抑制,重新进食0.5 h后,其表达量快速上调,表明进食影响LmCHS2的表达。【结论】LmCHS2参与中肠围食膜的形成,对飞蝗的生长发育至关重要,该基因的沉默影响中肠围食膜的完整性,使飞蝗对食物的消化吸收困难,最终因饥饿而死亡;此外,该基因的表达受飞蝗进食的调控。

嗜虫书虱几丁质合成酶2基因的克隆与功能研究

研究嗜虫书虱(Liposcelis entomophila)几丁质合成酶2(Liposcelis entomophila chitin synthase 2,LeCHS2)基因的表达模式及其在嗜虫书虱发育过程中的生物学功能,以期为嗜虫书虱的防治及特异性杀虫剂的新靶标筛选提供理论基础。本研究克隆获得了LeCHS2,其完整的编码区序列(coding sequence,CDS)为4524 bp,编码1507个氨基酸,运用生物信息学软件分析发现,其具有17个跨膜结构域,预测蛋白分子的质量为172.9 kDa,理论等电点为6.24,不具有信号肽。LeCHS2的氨基酸序列与其他8种昆虫几丁质合成酶2(chitin synthase 2,CHS2)的同源性为49.05%~53.67%。系统发育树显示,LeCHS2与人体虱(Pediculus humanus corporis)CHS2亲缘关系最近。实时定量PCR(real time quantitative PCR)检测LeCHS2基因在嗜虫书虱不同发育阶段和不同组织部位的表达模式,发现LeCHS2在嗜虫书虱的中肠和后肠中高表达,说明该基因主要在中肠、后肠中发挥作用;若虫期的表达量高于成虫期的,在若虫期第1天、第11天表达量最高。为研究LeCHS2的功能,本研究采用壳聚糖(chitosan,CS)与三聚磷酸钠(tripolyphosphate,TPP)交联产生纳米级递送载体,形成CS-TPP-dsLeCHS2的复合物进行RNA干扰(RNA interference,RNAi)。连续饲喂CS-TPP-dsLeCHS224、48、72、96 h后,LeCHS2基因表达量显著降低,实时定量PCR检测其干扰效率,LeCHS2基因表达量分别下降79.4%、47.0%、40.0%和25.0%,连续饲喂8 d后嗜虫书虱的存活率为56.6%。干扰LeCHS2后,对腹部外部形态观察发现,嗜虫书虱的体长缩短了17%,腹部厚度减少了18%,体重显著下降;组织切片观察发现,围食膜缺失导致肠道上皮细胞裸露,说明LeCHS2的功能与中肠围食膜的形成有关,对其生长发育至关重要。研究结果表明采用饲喂法干扰LeCHS2后对嗜虫书虱围食膜的形成有破坏作用,从而影响其进食和消化吸收,使其生长发育受阻并最终死亡。

锈赤扁谷盗几丁质合成酶2基因的克隆与功能研究

几丁质主要存在于真菌的胞壁、甲壳类动物的外壳和昆虫的体壁中,高等哺乳动物不含有几丁质,因此根据几丁质生物合成途径研发新型杀虫剂已经成为当今热点。本研究以锈赤扁谷盗Cryptolestes ferrugineus为研究对象,利用实时荧光定量PCR(qPCR)和RNAi技术对几丁质生物合成途径中的关键酶-几丁质合成酶2(CHS2)基因的特性和功能进行了深入的研究,为以后利用几丁质合成酶来防治锈赤扁谷盗提供理论基础与科学依据。我们首先以获得的锈赤扁谷盗转录组数据为基础,对其中一个预测为编码几丁质合成酶2的基因进行了克隆,首次获得了锈赤扁谷盗几丁质合成酶2基因完整的开放阅读框,命名为CfCSH2(NCBI登录号:MH234580),其开放阅读框ORF包含4 428bp,编码1 475个氨基酸,其中的322(523—845)个氨基酸是几丁质合成酶的保守序列,含有几丁质合成酶特有的标签序列EDR和QRRRW。实时荧光定量PCR结果显示,CfCSH2在锈赤扁谷盗卵、幼虫、蛹和成虫不同发育阶段均有表达,但表达量差异显著(P<0.05)。幼虫阶段CfCSH2在1龄的相对表达量最多,随后逐渐减少,在蛹期表达量最低,卵期有少量表达,成虫期最多,说明该基因在锈赤扁谷盗进食期表达量较多,非进食期表达量较少。CfCSH2在锈赤扁谷盗不同组织的表达量有显著差异(P<0.05)。在成虫表皮中基本不表达,在头部、胸部、脂肪体中有少量的表达,腹部的表达量最高,其次是中肠,腹部的高表达量可能与其样晶体积较大,包含组织较多有关。RNAi干扰实验结果表明:无论使用注射还是饲喂的方法,CfCHS2基因沉默后幼虫均出现躯体蜷缩,腹部干瘪,无法正常爬行的现象。对RNAi处理后的锈赤扁谷盗的中肠进行了甲苯胺蓝染色和透射电镜的研究,结果发现经过沉默CfCHS2基因后的幼虫中肠围食膜缺失,肠道上皮细胞没有围食膜的保护,不能附着在中肠横肌,严重受损。这些结果说明CfCHS2在锈赤扁谷盗中肠围食膜的形成过程中发挥重要的作用。CfCHS2基因的沉默会使锈赤扁谷盗发育受阻,导致死亡。实验选用纳米壳聚糖作为传递载体,通过饲喂法使目的基因的表达量显著下降,锈赤扁谷盗死亡率显著升高,为以后基于RNAi技术防治锈赤扁谷盗提供了科学依据。