东方蜜蜂微孢子虫一新孢壁蛋白NcER_100148的鉴定与生物学功能研究

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae作为蜜蜂微孢子虫病的主要病原体,对其侵染机制的相关研究鲜有报道。本研究旨在对团队前期通过质谱鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148进行原核表达,明确其亚细胞定位,并初步探索其生物学功能。【方法】通过在线软件对前期鉴定的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148序列进行生物信息学分析;利用RT-PCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染后西方蜜蜂Apis mellifera成蜂中肠中NcER_100148的表达量;将NcER_100148基因片段克隆至原核表达载体pET30a中,IPTG诱导表达重组蛋白并用于制备多克隆抗体;利用Western blot检测NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的表达量;通过间接免疫荧光和免疫电镜技术分析NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的亚细胞定位;利用Western blot和免疫共沉淀法分别分析重组蛋白NcER_100148与东方蜜蜂微孢子虫几丁质孢子壳(chitin spore coats,CSCs)和极管蛋白NcPTP2和NcPTP3的相互作用关系。【结果】序列分析结果表明,东方蜜蜂微孢子虫NcER_100148预测分子量为12.169 kD,含1个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和1个糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定位点;RT-PCR检测结果表明,NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫感染后4 d时的西方蜜蜂成蜂中肠中开始表达;Western blot结果表明,NcER_100148蛋白能在成熟孢子表面表达,并且能够与东方蜜蜂微孢子虫的CSCs互作;亚细胞定位结果显示NcER_100148定位于东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上;Western blot和免疫共沉淀结果显示重组蛋白NcER_100148能够与极管蛋白NcPTP2和NcPTP3相互作用。【结论】NcER_100148是定位在东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上的一个新型孢壁蛋白,且其可能在孢子内壁的构建、极管的盘绕与固定和参与对宿主的侵染等过程中扮演重要的角色。