棉铃虫围食膜肠粘蛋白HaIIM72真核表达及几丁质结合活性检测

在前期工作中,本实验室已成功克隆得到棉铃虫粘蛋白基因haiim72。为了研究粘蛋白HaIIM72的生化特性,本试验将haiim72基因克隆到质粒pFastBacTM,转化大肠杆菌DH10Bac,构建重组杆状病毒bacmid-hai-im72,转染昆虫细胞系BTI-TN-5B1-4(HighFive)从而在昆虫细胞系中进行表达。结果表明:成功表达了分子量约260kDa的棉铃虫围食膜肠粘蛋白HaIIM72。几丁质结合活性试验表明,肠粘蛋白HaIIM72具有几丁质结合活性,能够被较强的变性剂洗脱,属于第三类围食膜蛋白。

甜菜夜蛾SeCDA8的基因克隆、蛋白表达及几丁质结合活性分析

几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)能催化几丁质脱乙酰化产生壳聚糖,在几丁质降解过程中发挥着重要作用。本研究通过分析甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)转录组得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的全长CDS序列,命名为SeCDA8(GenBank登录号为OL689577),其开放阅读框为1158 bp,编码385个氨基酸。NCBI Blast和系统进化分析表明其属于肠道特异CDA蛋白,与斜纹夜蛾CDA相似度最高。成功构建原核重组表达载体pET30a-SeCDA8,转化大肠杆菌,经超声破碎后在沉淀中表达45 kD的重组蛋白。重组Se CDA8蛋白的几丁质结合活性分析结果显示,Se CDA8蛋白与再生几丁质的结合活性较高于胶体几丁质,但均较弱。q RT-PCR分析显示,Se CDA8在前肠和中肠前部高表达,推测其可能与围食膜形成有关。通过探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶Se CDA8蛋白的几丁质结合活性和组织定位,为更加深入地探究第Ⅴ类CDA的生理功能提供了重要的理论依据。

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA7的表达与结合活性分析

几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标。通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因(GenBank登录号为MG604929),该基因长1431bp,包含开放阅读框长1134bp,SeCDA7蛋白的预测分子量分别为43.156kD。结构域分析显示,SeCDA7具有一个多聚糖乙酰基转移酶催化区,属于第Ⅴ类CDA蛋白。分别构建了原核和真核重组表达载体,利用大肠杆菌和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统转染Sf9昆虫细胞,成功表达了SeCDA7蛋白,纯化SeCDA7蛋白并分析几丁质结合活性,结果表明SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性;荧光定量PCR结果显示secda7基因主要在中肠组织表达。本研究实现了甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因secda7的外源表达,并鉴定出SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性,为深入探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的生理功能提供了理论依据。

暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因的细胞表达及活性分析

cdsRDNA文库免疫筛选到编码暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶HpdsRCDA5基因,序列分析表明HpdsRCDA5含有1个几丁质脱乙酰酶结构域,属于GroupdsRV类CDA蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pdsRFastdsRBac-HpdsRCDA5,转染昆虫细胞sf9,WesterndsRblot分析表明HpdsRCDA5在昆虫细胞sf9中成功表达42dsRkdsRDa的蛋白。利用qdsRRT-PCR方法分析HpdsRCDA5基因组织表达,结果显示HpdsRCDA5基因在中肠中表达最高,为中肠特异表达蛋白。几丁质结合活性表明HpdsRCDA5蛋白只能被强洗脱剂洗脱,具有很强的几丁质结合活性。本研究通过对暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpdsRCDA5的生化特性研究,为进一步明确HpdsRCDA5的生理功能提供理论依据,并为以HpdsRCDA5蛋白为靶标的暗黑鳃金龟生物防治提供支撑。