两端融合表达几丁质结合结构域提高几丁质酶抗真菌活性

【目的】通过两端融合表达几丁质结合结构域来提高几丁质酶的活性和生物防治植物病原真菌能力。【方法】以苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalae)ACCC40021中唯一的GH19家族几丁质酶为模板,构建两端融合表达几丁质结合结构域的几丁质酶,并进行原核表达;利用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定几丁质酶活。【结果】成功构建了CatD_(ChiB) (催化结构域)、rChiB (含N-端几丁质结合结构域)、DChBD_(ChiB)(含两端几丁质结合结构域)三种形式的酶,并在大肠杆菌中得到了高效表达;与CatD_(ChiB)和rChiB相比,DChBD_(ChiB)显著地提高了对α-几丁质、胶体几丁质和黑曲霉几丁质的结合能力和活性;同时增强了其对病原真菌长枝木霉的抑制作用。【结论】两端融合表达几丁质结合结构域是简单有效的提高几丁质酶活性及抗真菌活性的策略。

一种新型贻贝抗菌肽的分离纯化及鉴定

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部海域,其体内富含各种抗菌肽分子,是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,获得一种分子量为6261.55 D的具有抗菌活性的多肽成分;经多肽N端测序和基因克隆,结果表明该抗菌肽由55个氨基酸残基构成,含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。结构域分析表明该抗菌肽具有几丁质结合结构域(Chitin-biding domain),因此将该抗菌肽命名为mytichitin-A。Mytichitin-A对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用,同时对真菌及革兰氏阴性菌也具有抑制作用。荧光定量PCR检测表明,mytichitin-A主要在厚壳贻贝的性腺组织中表达且在细菌诱导后12h其表达量达到峰值。研究为深入了解厚壳贻贝抗菌肽的分子多样性及免疫机制奠定了基础。

厚壳贻贝抗菌肽mytichitin-CB的固相化学合成、复性及功能

抗菌肽是贻贝免疫系统的重要组成部分,也是开发新型生物抗生素的先导分子。厚壳贻贝抗菌肽mytichitin-CB是厚壳贻贝几丁质酶的C端天然裂解产物,具有几丁质结合结构域及抑菌活性。Mytichitin-CB分子在厚壳贻贝血清中含量极低,妨碍了后续研究。为深入研究mytichitin-CB的结构与功能,采用固相化学合成手段,成功合成了mytichitin-CB肽段,采用反相高效液相色谱和质谱对合成后的mytichitin-CB进行了纯度和精确分子量验证。通过氧化复性策略对合成后mytichitin-CB进行了成功复性,复性后的mytichitin-CB开展了抑菌活性测试,热稳定性和几丁质结合活性分析。结果表明合成mytichitin-CB对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌具有明显的抑制活性;经60℃温度处理后,其抑菌活性未见明显下降;合成mytichitin-CB与几丁质具有可逆结合作用。上述研究表明,合成mytichitin-CB具有与天然mytichitin-CB相似的结构与功能,可用于开展后续抗菌机制分析,同时,其较强的抑菌活性和较好的热稳定性为后续基于mytichitin-CB的生物抗生素研发奠定了基础。