几丁质脱乙酰酶的生物学功能、三维结构及其抑制剂的研究进展

由于农用化学品存在靶标有限性和耐药性等问题,新靶标的开发成为农药研发的重中之重。几丁质是昆虫表皮和真菌细胞壁的主要组成成分,具有重要的生物学功能。几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)可将几丁质脱乙酰化为壳聚糖,这一过程除了影响昆虫体壁和真菌细胞壁的形成外,还可调控昆虫的生长发育或决定病原菌的致病性。越来越多的研究表明,CDA有望成为新农药创制的候选靶标。本文介绍了CDA作为作物保护潜在靶标的研究进展,主要综述了当前不同来源CDA的生化功能、晶体结构、酶与底物的结合模式和以及近年来已报道的以CDA为靶标的抑制剂的研究进展,可为以几丁质脱乙酰酶为靶标的抑制剂的筛选以及新型农药的开发提供指导。

Rhizopus stolonifer几丁质脱乙酰酶的异源表达及其与几丁质酶的协同作用研究

几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)是几丁质生物转化为壳聚糖的关键酶。然而,目前报道的高活性CDAs非常少。为了获得高效的CDA,并提高其对几丁质的生物转化效率,该研究对来源于Rhizopus stolonifer中的CDA进行基因克隆、表达及纯化,获得几丁质脱乙酰酶Rs CDA1,研究其酶学性质并探究其与来源于Vibrio harveyi的几丁质酶Vh Chit2对几丁质的协同水解作用。结果表明,Rs CDA1的比酶活力为5.2 U/mg,在45℃、pH 6.5条件下活性最高,在温度低于40℃、pH 6.5~8.0保持较好的稳定性。1 mmol/L的Ca^(2+)、Mn^(2+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)、Ba^(2+)和Co^(2+)对Rs CDA1的活力有促进作用;1 mmol/L的Ni^(2+)和Cu^(2+)对该酶有抑制作用。此外,Rs CDA1与Vh Chit2在几丁质水解中表现出良好的协同降解和脱乙酰作用。Rs CDA1与Vh Chit2(摩尔浓度比为10∶1)在50℃、pH 6.5条件下水解20 mg/mL几丁质2 h时,对几丁质酶和CDA的协同度分别达到120.3%和175.6%。与单独使用Rs CDA1相比(27.5%),两者协同水解时几丁质的脱乙酰度增加到35.3%。因此,Rs CDA1在几丁质的生物转化中具有潜在的应用前景。

豌豆蚜几丁质脱乙酰酶(ApCDAs)的鉴定及表达特性

通过BLAST比对和软件分析,共筛选出4个豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)几丁质脱乙酰基因( ApCDA1、 ApCDA2、 ApCDA3和 ApCDA5),并分析了其生物学信息;通过实时荧光定量PCR技术,发现4个ApCDAs在各发育阶段均有表达,其中, ApCDA1基因在1龄、2龄若虫和成虫期表达量较高;ApCDA2基因在4龄若虫的表达量高于其他龄期;ApCDA3基因在各发育阶段后期的表达量显著高于前期和中期,2龄若虫后期表达量最高;ApCDA5基因在3龄若虫的表达量偏高,2龄后期的表达量最高;此外, ApCDA1和 ApCDA3在3龄若虫和成虫中肠、胚胎和表皮内的表达量均显著高于 ApCDA2和 ApCDA5。结果表明,ApCDAs基因对豌豆蚜的生长发育和蜕皮具有重要作用。

破壁方法对红球菌11-3胞内几丁质脱乙酰酶释放的影响

红球菌11-3是一株高产几丁质脱乙酰酶(CDA)的菌株,几丁质在该酶的催化作用下可转化为壳聚糖,该酶在壳聚糖的生产中具有重要作用。红球菌11-3菌株所产CDA为胞内酶,成为催化反应的一大障碍。为了提高CDA的释放率,本研究首先利用不同的物理方法(反复冻融、超声、球磨、匀浆和液氮研磨)、化学方法(表面活性剂处理、氯仿处理)和生物学方法(溶菌酶处理)对红球菌11-3进行破壁处理,测定CDA酶活力和释放率,并通过扫描电子显微镜观察细胞形态变化。结果表明,不同方法的破壁效果存在很大差异,其中,液氮研磨法破壁效果最佳,菌体表面出现细密的孔洞,CDA释放率为45.13%,总酶活力损失率为2.03%;匀浆处理法次之,CDA释放率为16.00%,总酶活力损失率为9.18%。利用匀浆和液氮研磨联合处理红球菌11-3细胞,细胞表面产生更多、更大的孔洞,CDA释放率高达86.17%,总酶活力损失率为9.11%,上清液中CDA酶活力为480.2 U/mL,较液氮研磨法相比提高了1.48倍。结论:匀浆和液氮研磨联合处理可有效破坏红球菌11-3细胞壁,提高胞内CDA释放效率。本研究结果对红球菌11-3内CDA应用于壳聚糖的生产具有参考作用。

美国白蛾几丁质脱乙酰酶1(HcCDA1)的克隆表达与酶活测定

利用RACE-PCR方法,扩增得到编码美国白蛾Hyphantria cunea Drury几丁质脱乙酰酶基因Hc CDA1。将该基因分别在大肠杆菌BL21和毕赤酵母细胞Pichia pastoris GS115表达。经诱导表达后,Western blot分析表明Hc CDA1在大肠杆菌中成功表达61.8 k D的蛋白,符合预期大小;在毕赤酵母GS115中成功表达80 k D蛋白。酶活性试验显示酵母细胞中表达的重组蛋白酶活力为1.685 U/m L。本研究利用毕赤酵母成功表达具有酶活力的重组Hc CDA1蛋白,为进一步明确该蛋白的生理功能提供条件。

一种简易、高效产几丁质脱乙酰酶菌种的筛选方法

几丁质脱乙酰酶是催化几丁质直接脱乙酰生成壳聚糖的一种酶,已报道的酶活力测定方法存在操作复杂、底物昂贵等不足,不适合用于菌种筛选。研究中建立了1种分光光度法测定几丁质脱乙酰酶酶活的新方法,该方法具有操作简便,稳定性、重现性好等特点,适合于菌种筛选工作。

美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质

【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长c DNA序列;构建原核重组表达载体p ET30a-Hc CDA2,克隆获得编码美国白蛾Hc CDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体p Fast Bac-Hc CDA1和p Fast Bac-Hc CDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾Hc CDA1(前期研究所得)和Hc CDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白Hc CDA1和Hc CDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶Hc CDA1&2的酶活力,对其最适反应温度、最适p H以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长c DNA序列,命名为Hc CDA2(Gen Bank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明,Hc CDA1和Hc CDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 k D蛋白。酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的Hc CDA1和Hc CDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,当温度达到80℃时,Hc CDA2几乎失去酶活力;Hc CDA1酶促反应适宜的p H范围为7.0—9.0,并且Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应的最适p H均为8.0;在最适反应条件下,Hc CDA2蛋白酶活力均高于Hc CDA1蛋白酶活力;Mg^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)和Ca^(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn^(2)+对Hc CDA1抑制作用逐渐增强,而Mg^(2+)对Hc CDA1的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势,而且Mg^(2+)和Ca^(2+)对Hc CDA2的抑制作用也是呈现先升高后降低的趋势。Co^(2+)和Fe^(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应有激活作用,随浓度增大,Fe^(2+)激活作用越强,而Co^(2+)激活作用则呈现先升高后降低的趋势。【结论】克隆了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因(Hc CDA2),在原核细胞中表达61 k D目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性抗体。得到具有活性的美国白蛾几丁质脱乙酰酶Hc CDA1和Hc CDA2,两者在体外均检测到催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,最适pH均为8.0。

几丁质脱乙酰酶的研究进展

几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)是可以催化几丁质脱乙酰基反应生成壳聚糖的酶类。壳聚糖因其具有抗菌、抗癌、抗病毒等特性,在医药、化工、食品等行业具有广阔的应用前景。对CDA的研究概况进行了综述,包括酶学性质、催化机理、分离纯化的方法等,同时对CDA产生菌的筛选方法及过程做了简要的阐述,并对CDA今后的重点研究方向进行了展望。

几丁质脱乙酰酶(CDA)的研究进展

综述了国内外对几丁质脱乙酰酶(CDA)的研究概况,包括酶的微生物来源、性质、酶的底物特性、酶的生物学功能和酶的基因等,并对CDA潜在的应用价值进行了展望。

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA7的表达与结合活性分析

几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标。通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因(GenBank登录号为MG604929),该基因长1431bp,包含开放阅读框长1134bp,SeCDA7蛋白的预测分子量分别为43.156kD。结构域分析显示,SeCDA7具有一个多聚糖乙酰基转移酶催化区,属于第Ⅴ类CDA蛋白。分别构建了原核和真核重组表达载体,利用大肠杆菌和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统转染Sf9昆虫细胞,成功表达了SeCDA7蛋白,纯化SeCDA7蛋白并分析几丁质结合活性,结果表明SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性;荧光定量PCR结果显示secda7基因主要在中肠组织表达。本研究实现了甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因secda7的外源表达,并鉴定出SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性,为深入探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的生理功能提供了理论依据。

一株产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选、鉴定及发酵优化

目的:从海洋样品中筛选产几丁质脱乙酰酶细菌,对菌株进行鉴定和发酵条件优化。方法:利用显色平板从黄海海州湾燕尾港海域的海泥中筛选几丁质脱乙酰酶产生细菌。利用形态学、生理生化特性以及16S r DNA序列分析对菌株进行鉴定。利用单因素实验和正交实验优化菌株发酵条件。结果:筛选获得几丁质脱乙酰酶产生菌MCDA01,经形态学特征、生理生化特性以及16S r DNA序列分析将菌株鉴定为天目不动杆菌(Acinetobacter schindleri)。菌株最佳生长条件为30℃,p H8.0,Na Cl 4%。最佳产酶发酵条件为:发酵时间60 h,发酵温度20℃,培养基起始p H7,装液量20%,诱导剂几丁质浓度1%。在此条件下,产酶量达到201.37 U/m L,比优化前提高了4.14倍。结论:几丁质脱乙酰酶产生菌MCDA01产酶量达到201.37 U/m L,有工业应用潜力。

产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选鉴定及产酶条件优化

从海洋样品中筛选产几丁质脱乙酰酶的细菌,对高产菌株进行鉴定,并利用响应面法优化其发酵条件。结果表明,利用添加硝基乙酰苯胺的平板,根据黄色变色圈从海州湾海域海泥样品中筛选获得一株产几丁质脱乙酰酶的细菌MCDA3-3。通过形态学、生理生化特征以及16S r DNA序列分析,将该菌株鉴定为海洋硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)。利用单因素和响应面法优化菌株MCDA3-3发酵产酶培养基和培养条件,获得最佳发酵培养基配方为木薯淀粉1.1%,玉米浆1.0%,Fe Cl3·6H2O 0.045%,陈海水配制,p H 5.7;最佳发酵条件为接种量4%,30℃、180 r/min发酵48 h。在此条件下酶活为4.07 U/mL,是优化前的2.3倍。

一株产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选、鉴定及发酵优化

利用对硝基-N-乙酰苯胺筛选培养基从海州湾海域海泥中筛选获得产几丁质脱乙酰酶细菌MCDA02。经过形态学、生理生化和16S rDNA序列分析初步鉴定该菌株为解角质素微杆菌。通过单因素优化和正交试验优化,得出最优发酵条件。在单因素优化基础上,利用正交试验优化获得菌株MCDA02最优发酵条件为发酵温度25℃,培养基起始p H7.0,装液量50 m L/250 m L,几丁质3%,发酵时间48 h。在此发酵条件下,菌株MCDA02发酵水平达到158.47 U/m L,是优化前的3.2倍。试验结果为菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶的进一步研究奠定基础。

储存条件对菌株11-3几丁质脱乙酰酶稳定性的研究

实验室保藏一株产几丁质脱乙酰酶(CDA)的菌株11-3,研究发现该菌所产CDA为胞内酶,在储存过程中其酶活稳定性很差,易失活。为保证该酶的后续研究,从几个方面考察了酶稳定性的影响因素,从而得出酶的最佳储存条件:干菌体储存于-20℃,2个月后酶活损失率仅为0.98%。

一株产几丁质脱乙酰酶丝状真菌的发酵条件优化研究

针对已筛选出的一株能生产几丁质脱乙酰酶(CDA)的海洋丝状真菌,考察其最佳发酵培养基和发酵条件。通过单因素与正交实验得出该菌的最佳产酶条件为:初始p H为6.0,发酵温度为30℃,发酵时间为108 h,葡萄糖浓度7 g/L,酵母浸膏浓度7 g/L,氯化钙浓度0.75 g/L,几丁质浓度1.25 g/L,Na Cl浓度为1.4%。通过酶活的测定,发现该丝状真菌合成的几丁质脱乙酰酶主要是胞外酶。在最佳发酵条件下该丝状真菌的最高CDA胞外酶活为21.37 U/m L。是一株具有开发潜力的几丁质脱乙酰酶生产菌株。

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶1(SeCDA1)在毕赤酵母中的表达与活性测定

利用RACE-PCR方法,扩增得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因secda1。将secda1基因插入到载体p PIC9K多克隆位点,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,得到重组质粒p PIC9K-secda1。重组质粒经线性化后,电击转化缺陷性毕赤酵母GS115感受态细胞,构建含有目的基因的重组酵母菌株。经甲醇诱导表达,Western blot分析后表明secda1基因在毕赤酵母GS115中成功表达80 k Da蛋白。脱乙酰基酶活性测定结果显示重组蛋白酶活力为1.35 U/m L。利用RT-PCR对该基因进行m RNA水平上的表达分析,结果表明secda1在幼虫取食期的头、表皮、中肠、马氏管、脂肪体及蛹期虫体均有表达;本研究利用毕赤酵母成功表达具有酶活力的重组Se CDA1蛋白,为进一步明确Se CDA1蛋白的生理功能提供条件,并为以Se CDA1蛋白为靶标更有效地防治甜菜夜蛾提供理论依据。

蜜蜂螺原体几丁质脱乙酰酶基因的克隆、表达及酶学性质

[目的]通过表达载体p ET-28a（＋）在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase,CDA）基因chid,并测定其部分酶学性质,为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。[方法]利用Overlap Extension PCR（OE-PCR）定点突变技术,在引物设计时插入目的突变,通过3次PCR获得突变后的目的片段,测序验证后构建重组质粒p ETchid,挑取BLchid表达菌株。IPTG诱导表达目的蛋白,NTA-Ni2＋柱纯化,Western blotting验证,紫外分光光度法测定其酶活力和酶学性质。[结果]DNA测序结果表明：chid基因中待突变位点已由TGA突变为TGG,成功克隆到chid基因全长,并得到外源表达的完整目的蛋白。该基因编码区为672 bp,编码的氨基酸构成相对分子质量约28×103的蛋白,同源性比较发现其与S.melliferum KC3/BC3/IPMB4A菌株序列相似性为97%。测得外源表达的该酶活力最高可达10.14 U·m L-1,最适温度为50℃左右,最适p H值为7.0~7.5。[结论]首次克隆了螺原体几丁质脱乙酰酶基因chid,并得到具有活性的外源目的蛋白,为后续研究螺原体与宿主蜜蜂的相互作用及其致病机制提供了重要信息。

红球菌利用小龙虾壳粉产几丁质脱乙酰酶的培养条件优化

为了利用小龙虾壳和降低几丁质脱乙酰酶的生产成本,以小龙虾壳粉作为培养基主要成分,接种红球菌11-3菌株发酵生产几丁质脱乙酰酶。首先对培养基进行蛋白酶水解预处理;然后,通过单因素试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验及Box-Behnken试验,对补充营养成分和环境条件进行优化。结果表明:19%虾壳粉起始培养基,用5 U/mg添加量的碱性蛋白酶处理4 h,补充1%蔗糖、0.25%硫酸铵和0.75%玉米浆,以3%的接种量接入红球菌,200 r/min振荡培养2.5 d,产酶活力高达2 723 U/mL,比起始培养基提高约53倍。以虾壳粉为主要成分的培养基可产生高酶活力的几丁质脱乙酰酶,为小龙虾壳的综合利用提供了一条新途径,也为未来使用生物法从虾壳中直接提取壳聚糖提供基础数据。

海洋细菌Microbacterium esteraromaticum MCDA02产几丁质脱乙酰酶发酵条件优化

从海洋样品中筛选几丁质脱乙酰酶产生菌,对产酶水平较高菌株进行鉴定,并对发酵条件进行优化。采用对硝基乙酰苯胺为指示剂,通过变色圈法筛选获得几丁质脱乙酰酶的海洋细菌菌株MCDA02。通过形态学特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析,将其鉴定为Microbacterium esteraromaticum。通过单因素实验结合响应面设计对菌株MCDA02产几丁质脱乙酰酶的发酵条件进行优化,获得该菌株的最佳培养基配方为胰蛋白胨1%、木薯淀粉1.1%、ZnSO40.05%。发酵条件为初始pH7.9,30℃、180r/min、发酵72h、接种量1%、装液量20%。在此条件下菌株MCDA02发酵产几丁质脱乙酰酶水平2.01U/mL,比优化前提高了1.41倍。

几丁质脱乙酰酶高产菌株的选育及其发酵特性研究

以一株海洋丝状真菌(Penicillium janthinellum)UV-0S为出发菌株,通过多级紫外线诱变育种后获得几丁质脱乙酰酶(CDA)高产突变株UV-3S,并对该菌株产CDA的发酵特性及其细胞壁几丁质的脱乙酰度(DD)进行研究。结果表明,突变株UV-3S的胞外CDA酶活力为11.05 U/m L,是出发菌株UV-0S的2.1倍。该菌株产胞外CDA的最适初始p H值为9.0,最适无机盐为NaH_2PO_4(11 mmol/L),胶体几丁质最适添加量为0.5%。在此最佳发酵条件下,突变株UV-3S的CDA酶活力最高,为11.83 U/m L,说明CDA是一种诱导酶。细胞壁几丁质的脱乙酰度随真菌生长而增加,且在发酵96 h后脱乙酰度达到最高(90.52%)。