改进RBB染色法初步筛选几丁质酶基因chiA的表达

对RBB(Remazol Brilliant Blue)底物染色方法进行产几丁质酶细菌的酶活性筛选,应用几丁质胶体平板诱导表达的筛选取得好的效果.粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA在E.coli中的异源表达过程:首先从质粒pMD-chiA(DH5α)中切出含粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA的片段,将其插入到表达载体pET-22b(+)内,构建成几丁质酶表达质粒pET-chiA.然后,转化进入DH5α感受态细胞内,鉴定正确后将pET-chiA质粒转入BL21(DE3)pLysS中进行表达,并进行初步筛选.

粘质沙雷氏菌几丁质酶基因ChiA克隆及生物信息学分析

通过生物信息学技术对Chi A基因序列进行分析预测,了解Chi A的基因结构及蛋白质性质。从自有菌株（粘质沙雷氏菌Serratia mareescens S68）中克隆到几丁质酶基因Chi A,利用相关软件对Chi A基因序列进行分析预测。Chi A基因全长1 714 bp,开放阅读框编码563个氨基酸,推测其编码的蛋白质分子量为60 983.8Da,等电点为6.35,是一种稳定的亲水性蛋白质。预测Chi A可能存在信号肽,切割位点在第23~24位氨基酸之间,1~23位氨基酸为其跨膜结构,其余肽链位于细胞外。Chi A主要存在3种二级结构元件,在二级、三级结构中都有体现。该Chi A是一种水溶性蛋白质,结构稳定且可以分泌到胞外。

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。

野生大豆与栽培大豆几丁质酶基因鉴定及其表达分析

几丁质酶是以几丁质等为底物的糖基水解酶(GH,glycosyl hydrolases),在植物生长发育及抵御逆境中发挥重要功能。然而,大豆几丁质酶基因的组织表达模式及对逆境的响应尚不清楚,影响了其在遗传改良中的应用。本研究分别鉴定野生大豆与栽培大豆几丁质酶基因,并分析其表达模式。结果发现,野生大豆与栽培大豆分别含62个和55个几丁质酶基因,位于17条和18条染色体上;进化树分析发现,117个基因分为5类,其中类群Ⅲ与类群Ⅴ属于GH18亚家族,类群Ⅰ、类群Ⅱ与类群Ⅳ属于GH19亚家族;启动子分析发现,几丁质酶家族成员包含响应激素及逆境胁迫顺式作用元件。栽培大豆几丁质酶基因表达分析发现,其在不同组织及抗病耐逆等过程差异表达,其中Gm.01G142400和Gm.13G346700等在接种花叶病毒的抗病品种叶片中诱导表达,Gm.03G254300和Gm.20G164600等在低磷胁迫的磷高效品种根系中诱导表达,Gm.08G259200和Gm.19G245400等在低磷胁迫根瘤中诱导表达;野生大豆几丁质酶基因表达分析发现,其在不同组织及耐盐过程差异表达,其中Gs.02G002604和Gs.02G002940等在盐胁迫耐盐品种叶片中诱导表达。以上结果为挖掘利用几丁质酶基因奠定了基础。

基于黏虫转录组的几丁质酶基因筛选和表达分析

昆虫的几丁质酶对昆虫的生长发育致关重要,是生物农药的重要靶标。本研究使用高通量测序技术对迁飞性害虫黏虫Mythimna separata的中肠和表皮组织进行了转录组测序、序列组装、功能注释及差异表达基因分析。对转录组数据库中鉴定出的几丁质酶基因进行了理化性质的预测,包括cDNA长度、蛋白质分子量、氨基酸序列、等电点、不稳定系数、跨膜结构和蛋白结构域等。使用MEGA软件构建了黏虫和其他昆虫几丁质酶的系统进化树,并通过q-PCR验证了黏虫基因在不同组织和发育阶段的表达模式。通过中肠与表皮的转录组测序,获得了19.42 Gb的数据,在COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot、eggNOG、nr数据库注释到了25236个Unigene;基因表达分析结果表明,中肠和表皮的差异表达基因共有3137个,其中中肠高表达基因有1872个,表皮高表达基因有1265个。从转录组数据中鉴定出9个几丁质酶基因,其中7个是新的几丁质酶基因,这些基因的cDNA长度在1362~9816 bp,SMART结构预测表明几丁质酶含有1个或多个催化结构域。构建的系统进化树将昆虫几丁质酶基因分为9个亚家族。q-PCR结果表明MsCht2、MsCht5、MsCht6、MsCht7、MsIDGF1在表皮中表达量较高,MsCht4、MsCht11和MsChi-H在中肠中表达量较高,与转录组数据一致;多数几丁质酶基因在蛹期或预蛹期表达量最高,而MsCht4在5龄期表达量最高,在蛹期表达量很低。黏虫几丁质酶基因表达上存在不同的差异,不同的几丁质酶基因可能具有不同的功能。本研究筛选出了7个新的几丁质酶基因,为黏虫的生物防治提供了新的靶标。研究结果为进一步研究黏虫几丁质酶的功能奠定了基础。

低温几丁质酶chiA基因克隆、同源建模及序列分析

从假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)中克隆低温几丁质酶chiA基因(Gen Bank登录号KF234015)。该序列全长3160个核苷酸,编码1053个氨基酸,预测相对分子质量113.5 KDa,等电点(pI)4.49,命名为chiA。功能结构域分析显示其编码区包含信号肽、2个几丁质结合域、2个成人多囊肾病结构域、18家族几丁质酶催化域与18家族糖苷水解酶C端部分序列。利用Discovery Studio平台以同源建模的方法构建低温几丁质酶chi A的催化域三维结构模型,并对其进行结构优化和评估,Ramachandram图谱检测和Verify-3D评估显示模拟出的模型结构合理,整体的相容性较为可信。本结果拟为后期低温几丁质酶chiA的催化机理研究提供理论依据。

导入β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究

利用农杆菌转化法,将组成型表达β1,3葡聚糖酶及几丁质酶基因的双价植物表达载体pBLGC转化优质甘蓝型油菜品种H165,并得到了抗卡那霉素(Kanamycin,Kan)的再生植株。我们对所得到的抗Kan的再生苗进行了初步分子生物学检测,结果表明,在K15(Kan15mg/L)培养基上的绿苗中有30%为PCR阳性植株,而在K25(Kan10mg/L)培养基上的绿苗有53%的阳性率。对部分PCR阳性的转基因植株进行了点杂交分析,结果均表现出较强的杂交信号,这初步说明外源基因已整合到油菜基因组中。转基因植株的活体接种油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorium)试验表明,部分转基因植株比对照显示较强抗病性。

几丁质酶-葡聚糖酶双价基因导入滇型杂交稻恢复系提高稻瘟病抗性的研究

将含有菜豆 (Phaseoluslimensis)几丁质酶基因和烟草 (Nicotianatabacum) β 1,3 葡聚糖酶基因的pBLGC(16 5kb)质粒用基因枪法导入滇型杂交稻 (OryzasativaL .ssp .japonica)恢复系“南 2 9”中 ,总计获得 93个转化再生植株 ,以β 1,3 葡聚糖酶基因制备探针对T1 代株系进行Southern杂交分析 ,17个株系为杂交阳性 ,证实外源基因完整结构已整合到水稻基因组中 ;连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T4 代 ;对所获得的 6个PCR检测阳性T4代品系进行了稻瘟病菌 (Magnaporthegrisea)生理小种接种鉴定和稻瘟病大田诱发鉴定 ,结果表明 ,转基因品系对稻瘟病的抗性较受体对照大幅度提高 ,获得了稻瘟病新抗源 ,但不同品系稻瘟病抗性并不相同。

向大豆导入几丁质酶基因的初步研究

以根癌农杆菌的Ｔｉ质粒为介导，将抗真菌病的几丁质酶基因，导入黑龙江省栽培大豆－东农３７号，吉林２８号等１４个品种。从子叶节和下胚轴诱导出丛生芽，并再生植株，经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测，确认为转化植株。用花粉管通道导入法，直接导入几丁质酶基因，共获２２３粒种子，经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测的１１３株大豆幼苗中，有７株呈阳性反应，证明几丁质酶基因已导入并整合到大豆的基因组中。

转几丁质酶基因(RC24)水稻中大2号抗纹枯病特性研究

导入外源几丁质酶基因“RC2 4”的水稻中大 2号接种纹枯病菌的结果表明 ,接种病菌后病斑扩展速率和田间病情指数小 ,表现为对水稻纹枯病高抗。组织病理学研究表明纹枯病菌能侵入中大 2号 ,并引发纹枯病 ,入侵时间和症状出现的时间与非转基因感病对照没有显著差异 ,但病菌菌丝体消解现象出现早于对照 ,其抗病性主要表现为限制病菌扩展。以中大 2号与非转基因水稻材料配制的杂交组合的抗病性表明 ,杂交组合的抗病性均高于非转基因亲本 ,但其抗病性也会因母本的不同而有所变化。

东亚飞蝗几丁质酶家族基因的表达特性与功能研究

【目的】研究东亚飞蝗几丁质酶家族基因的时空表达特性及其在蜕皮发育中的生物学功能,筛选在飞蝗发育过程中致死性的几丁质酶基因,为实现基于RNAi的飞蝗有效控制提供重要的基础数据。【方法】在东亚飞蝗EST数据库搜索几丁质酶基因片段,用生物信息学方法分析所获得的基因片段序列;以飞蝗不同龄期第4天若虫和5龄东亚飞蝗不同组织部位为材料提取RNA并反转录为cDNA,应用RT-PCR方法研究时空表达特性;选取在表皮高表达的几丁质酶基因LmCht6,采用RNA干扰方法研究其生物学功能。【结果】基于东亚飞蝗EST库搜索和进一步的序列分析,共获得7条几丁质酶基因片段;不同组织部位与不同龄期RT-PCR结果表明这7条几丁质酶基因的时空表达特性存在明显差异,其中LmCht6主要在表皮表达;LmCht6的RNA干扰试验表明:2龄飞蝗注射dsLmCht6后,其几丁质酶基因LmCht6表达量明显降低;飞蝗从2龄到3龄的龄期转化过程中,表现为发育延迟,新表皮与旧表皮无法完全分离,导致死亡率达到72.2%。【结论】东亚飞蝗拥有多个几丁质酶基因,它们的时空表达特性存在差异;LmCht6在飞蝗蜕皮过程中具有十分重要的生物学功能,该基因被沉默后飞蝗无法完成蜕皮而导致死亡。

转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定

利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和β1,3 葡聚糖酶双价基因导入小麦品种扬麦10号和Bobwhite ,共得到了13株T0 代转基因植株,2个小麦品种的转化效率分别为1 .4 %和1. 0 %。T1 代植株赤霉病抗性鉴定结果表明,转基因植株对赤霉病具有一定抗性,小穗发病率4 .76 %～11. 76 % ,低于抗病对照和感病对照。T1 代植株分子检测结果表明,外源基因分离比例为2. 33∶1,较低的分离比例可能与外源基因的丢失有关。

转几丁质酶-葡聚糖酶基因水稻稻瘟病抗谱分析

用来源于云南各地属于 2 4个稻瘟病菌 (Magnaporthegrisea)生理小种的 3 3个菌株 ,对受体品种南 2 9及其 4个转几丁质酶 β 1,3 葡聚糖酶串联基因水稻T5 代品系进行了温室接种鉴定。结果表明 ,不能侵染受体品种南 2 9的 13个菌株也不能侵染转基因品系 ,可侵染受体品种南 2 9的 2 0个菌株一般不能侵染转基因品系 ,转基因水稻对稻瘟病菌抗性范围较受体对照扩大 ,证明转几丁质酶 葡聚糖酶基因水稻对稻瘟病具有一定的广谱抗性 ;诱发条件下 ,转基因品系大田叶瘟病情指数为 0～ 1级 ,穗瘟发病率为 0 .3 %～ 10 .2 3 % ,抗性较受体对照大幅度提高 ,表明这些品系在稻瘟病抗病育种中是有应用潜力的。

基因枪法向小麦导入几丁质酶基因的研究

利用基因枪法,以菜豆几丁质酶基因转化小麦幼胚愈伤组织。在轰击压力1300psi,轰击距离6cm、100μg金粉/枪和轰击距离9cm、150μg金粉/枪的2种处理条件下,获得4株春小麦东农7742转化植株,转化频率分别为0.36%和0.56%。经PCR和PCR-Southern杂交分析,证实菜豆几丁质酶基因已整合到T0和T1小麦基因组中。采用氨基葡萄糖法测定几丁质酶活力,结果表明,转基因小麦的几丁质酶活力明显高于对照株;转基因植株对白粉病症状减缓,并获得一株赤霉菌接种未扩展的转基因T1植株。

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因导入甘蔗

将含有经过修饰的烟草(Nicotiana tabacumL.)Ⅰ类几丁质酶基因和Ⅰ类β-1,3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体pCG-Ⅱ在农杆菌介导下转化甘蔗优良品种ROC10和ROC22,获得抗G418的转化植株52株,经PCR检测33株呈阳性;对部分经PCR检测呈阳性的转化植株进行Southern杂交和黑穗病抗病性的体外抑菌实验,结果显示这两个基因均已整合到部分甘蔗的基因组中,且它们对甘蔗黑穗病的抗性均有不同程度的提高。

农杆菌介导西瓜转葡聚糖酶及几丁质酶双基因

采用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将含有葡聚糖酶基因和几丁质酶基因表达载体遗传转化西瓜(Citrulluslanatus),遗传转化体系为以子叶为外植体经过组织培养获得再生植株。结果表明,Kan抗性芽的分化率随着共培养时间的延长先上升后下降,GUS阳性芽的百分率逐渐升高,共培养时间30h后,GUS阳性芽的百分率趋于平稳,同时,通过对候选转基因植株中GUS基因染色鉴定、卡那基因、葡聚糖酶基因及几丁质酶基因特异引物PCR检测,表明葡聚糖酶和几丁质酶基因已成功导入西瓜植株中,转基因植株的表现在进一步研究中。

转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花株系对黄萎病的抗性

采用人工病圃、重病田及苗期室内鉴定相结合的方法,研究了转双价(Chi+Glu)基因的棉花株系61217-1对棉花黄萎病的抗性。结果表明,转基因棉花株系61217-1在人工病圃连续3年达抗病水平,病指极显著低于其受体中棉所24。2009年该转基因株系在河南安阳、江苏大丰及新疆石河子棉花黄萎病重病田的病指分别为18.7、18.1和16.7,均极显著低于受体中棉所24的病指。该转基因株系对来自河北、湖北、新疆的3个强致病力落叶型菌株均达抗病水平,病指分别为16.4、16.8和15.6,也极显著低于受体中棉所24的病指。表明转双价(Chi+Glu)基因的棉花株系61217-1具有优异稳定的抗黄萎病性。

细菌几丁质酶基因转化番茄的研究

为了获得抗真菌病的番茄材料 ,采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因转化番茄子叶 ,获得了抗卡那霉素的转化植株 ,PCR检测初步证明细菌几丁质酶基因已整合到番茄的基因组 .同时对番茄耐 Kan水平、转化受体的预培养以及共培后洗涤抑菌进行了研究 .结果表明 :卡那霉素质量浓度为 5 0 m g/ L 时就能完全抑制番茄子叶再生 ;共培后直接用抑菌剂洗涤的抑菌效果较好 ;番茄子叶预培养

转番茄几丁质酶基因西瓜植株的获得及其抗病性研究

构建了以C aM V 35s启动子驱动的含有番茄几丁质酶基因(Ch i3)的植物表达载体,通过冻融法导入根癌农杆菌(A g robacterium tum ef aciens)菌株EHA 105中,用叶盘法转化西瓜(C itru llus lana tus)栽培种“中育1号”,通过PCR、Sou thern b lot和RT-PCR鉴定,表明外源基因已成功整合到西瓜基因组中,并获得表达。利用尖孢镰刀菌西瓜专化型进行的转基因植株叶片粗提液抑菌效果检测,表明转基因植株的抗病性均有一定程度的增强。

香蕉一个Ⅲ类酸性几丁质酶基因与果实成熟关系的研究(英文)

为了解Ⅲ类酸性几丁质酶基因(MaCHⅢ)与香蕉果实采后成熟过程的相互关系,对经乙烯和1-甲基环丙烯(1-MCP)处理的巴西香蕉果实采后乙烯释放量、Ⅲ类酸性几丁质酶基因(MaCHⅢ)表达以及几丁质酶活性进行了测定。结果显示:(1)乙烯催熟处理的香蕉果实,乙烯释放量比对照处理的果实提前15 d达到高峰;1-MCP处理的香蕉果实,乙烯生物合成和果实成熟明显受到了抑制。(2)外源乙烯加速了MaCHⅢ基因的下调表达和Ⅲ类酸性几丁质酶活性的下降,MaCHⅢ表达量和Ⅲ类酸性几丁质酶活性分别在采后第3天和第4天下降到最小值。(3)1-MCP处理使MaCHⅢ基因呈现上调表达,Ⅲ类酸性几丁质酶活性上升,MaCHⅢ基因表达量和Ⅲ类酸性几丁质酶活性分别在采后18 d和25 d达到高峰。研究表明,MaCHⅢ基因可能与香蕉果实采后成熟呈负相关。