植物Ⅴ类几丁酶苦瓜同源基因(McChi5)的克隆及特征分析

苦瓜是一种病害很少的蔬菜作物。用 3′RACE方法从苦瓜叶片RNA中扩增了一个与烟草Ⅴ类几丁酶序列相似的片段 ,进一步用Y RACE方法扩增了相应的 5′端序列。经序列拼接 ,获得了植物Ⅴ类几丁酶苦瓜同源基因(McChi5 )的全长cDNA基因。该基因全长 1348bp ,含有一个 10 4 4bp的ORF。推测的蛋白质由 347个氨基酸组成 ,计算所得的分子量为 38.3kD ,等电点为 5 .77。同源性分析表明 ,McChi5蛋白与烟草V类几丁酶、拟南芥的推测几丁酶和类几丁酶蛋白、以及哺乳动物和细菌的一些几丁酶有序列相似性 ,并具有第 18家族糖基水解酶的保守域。Southernblotting表明 ,在苦瓜基因组中存在 2个拷贝的McChi5基因 ,同时也存在少数同源基因。RNAdotblotting分析表明 ,McChi5基因有组成性表达的特性 ,伤害处理对其表达的影响不明显。对McChi5基因可能的生物功能和应用作了进一步的讨论。

将菜豆几丁酶基因导入苹果砧木的研究

以苹果砧木八楞海棠（Ｍａｌｕｓｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ）为实验材料，用微束激光穿刺法将菜豆几丁酶基因导入苹果叶片，成功地获得了转基因植株。实验结果表明，以苗龄２６天的小苗上部刚展开的叶片再生频率可达１００％。经高渗缓冲液预处理后用激光微束穿刺导入外源ＤＮＡ可得到较高的转化频率。在１５０个再生叶片中经卡那霉素筛选得到２５株绿苗，经ＰＣＲ扩增检测，３株呈阳性结果，表明外源几丁酶基因已整合到苹果的基因组ＤＮＡ中。

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｃ２总ＤＮＡ经ＰｓｔＩ部分酶切后分离２～１０ｋｂ的片段，插入质粒ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点，转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ），利用几丁质平板从约８０００个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆（命名为ｐＣＨＴ１）。用１２种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明，重组质粒中的插入片段长３０ｋｂ，其中各有一个ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ和ＳｓｐＩ位点。把该克隆片段反向插入ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性，说明此片段含有一个完整的几丁酶基因，其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实了该片段来自于Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣ２基因组，且以单拷贝形式存在，它不能与来自于其它７株几丁酶产生菌的总ＤＮＡ杂交。

水稻中超氧诱导与稻瘟菌抗性及苯丙氨酸解氨酶、几丁酶、β-1,3-葡聚糖酶活性诱导的关系

19个水稻（OryzasativaL.）品种和8个稻瘟菌生理小种，或它们菌丝代谢产物（RBHM）组成的亲和与非亲和组合，及一些品种和稻瘟菌生理小种间交叉组合的实验结果表明.在非亲和组合中的水稻品种都有超氧（O2-）产率的诱导升高。毛地黄皂苷诱导O2-产率增高同时，也使稻苗对原亲和病原表现出抗性。二乙基二硫代氨基甲酸（DDTC）对超氧歧化酶（SOD）活性近乎完全抑制时，能使O2-产率猛增;N-乙烯马来酰亚胺（NEM）近乎完全清除O2-时，也可增加SOD活性。放线菌素D和环己亚胺处理后能抑制SOD活性，而使O2-产率明显增高。除了抗病时苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性诱导比感病时增长较强或较早外，无论用RBHM也好，毛地黄皂苷、DDTC、NEM也好，PAL活性都会增加。但它们都不能诱导几丁酶、β-1，3-葡聚糖酶活性升高。这样，PAL活性的诱导似乎并不是水稻对病原攻击一种特异的反应。几丁酶、β-1，3-葡聚糖酶活性诱导升高未必与O2-产率相关，而且诱导它们表达的信号传导与PAL也可能是不相同的。

免疫亲和层析法纯化苦瓜几丁酶

用扁豆几丁酶免疫家兔，获得抗扁豆几丁酶的抗体，将此抗体与Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ偶联，制备免疫亲和吸附剂，用以纯化苦瓜几丁酶．苦瓜叶片的粗提液经过免疫亲和吸附柱后，可获得电泳纯的几丁酶，其分子量为３５ ｋＤ，与用几丁质凝胶为亲和吸附剂的纯化结果一致．表明利用植物几丁酶在结构上的保守性，用免疫亲和法可纯化不同植物的同类几丁酶．与几丁质凝胶亲和柱相比，免疫亲和法纯化植物几丁酶具有快速、亲和柱可重复使用等的优点．利用免疫亲和层析获得的纯化样品，研究了苦瓜几丁酶对真菌的抑制试验，研究结果表明，苦瓜几丁酶能分解棉花枯萎病菌的菌丝体细胞壁制备物，并对其孢子芽管的伸长有一定抑制作用．

真菌诱导的植物几丁酶蛋白

几丁酶,水解几丁质真菌细胞壁的主要成分,该酶广泛存在于微生物和动植物中.近年来,植物几丁酶在植物抗真菌侵染过程中的作用和巨大的应用前景,已引起了人们的广泛关注.重点综述亲和组合、不亲和组合及内生菌根中真菌对植物几丁酶蛋白的诱导、几丁酶的组织细胞学定位及其抗真菌活性研究.

扁豆几丁酶的特性和诱导

采用再生几丁质亲和层析和两性电解质等电聚焦电泳，纯化了扁豆荚几了酶，其分子量３０ｋＤ，等电点为９．１，主要呈内切酶活性。扁豆荚中不同组织几丁酶比活力有很大差异。在豆荚发育过程中，其酶活性变化呈单峰曲线，而比活力则持续上升，表明扁豆几丁酶活性变化与发育相关。经ＨｇＣｌ２处理后，扁豆荚壳和种子的几丁酶活性均明显提高。在扁豆荚发育的不同阶段，几丁酶的诱导特性也有明显差异，幼嫩豆荚几丁酶诱导活性的增加更为明显。

苦瓜几丁酶的纯化及性质

几丁酶(EC 3·2·1·14)能将几丁质分解为寡聚N-乙酰胺基葡萄糖或N-乙酰胺基葡萄糖。几丁质是许多真菌细胞壁的主要成分。在高等植物中未发现几丁质的存在,但却广泛存在有几丁酶。近年来的研究表明,植物中的几丁酶在植物对病原真菌侵染所作出的保卫反应中有重要的作用。植物几丁酶的性质与功能已引起人们的兴趣和重视。苦瓜(Momordica charantia L.)是一种病害很少的蔬菜作物,其几丁酶的纯化及性质研究尚未见报道。为了探讨苦瓜抗病性的蛋白质基础,本文对此进行了研究。

几丁酶及其在植物抗真菌病中的作用

几丁酶(E G 3 2.1.14)是一种糖苷酶,在高等植物中普遍存在。其底物几丁质是一种由N-乙酰胺基葡萄糖聚合而成的多糖。至今未在植物体内发现此物质,但几丁质是许多危害植物的病原菌(如霉菌)的细胞壁的主要成分之一。因此人们自然联想到高等植物几丁酶在防御病原菌侵染中的可能作用。自本世纪30年代发现高等植物几丁酶活性以来,研究者们对几丁酶理化性质、生物学功能、可诱导性等方面做了些研究工作。

几丁酶细菌的分离和抗病虫研究

】从土壤中分离出１株杆状细菌，具有显著的产几丁酶活性。对稻瘟病、赤霉病和大斑病病源菌丝生长的抑制效果达４９．３％～８４．３％，并能增强杀虫剂的杀虫效果，减少药量１～４倍。

利用增强子样DNA片段提高几丁酶基因的表达

将来源于环状芽孢杆菌 (Bacilluscirculans)C 2中增强子样DNA片段插入质粒 pCHT1的几丁酶基因 5’ 端 ,构建成重组质粒pCHTX+ 和pCHTX- .将含pCHT1,pCHTX+ 和pCHTX- 质粒的大肠杆菌转化子分别点种在几丁质平板上 ,不同菌株产生了不同大小的水解圈 .利用比色法测定不同菌种的几丁酶活性发现 ,在大肠杆菌中 ,该片段的插入可促进几丁酶基因的表达 。

植物几丁酶与抗病性的关系

植物体内普遍存在几丁酶而未发现其底物，几丁酶在植物保卫机制中所起作用是一个十分重要的研究课题。本文通过不同发育程度植物中几丁酶活性与抗病性的关系，病原菌及灭活菌体处理对植物几丁酶的影响。

植物几丁酶的分子生物学研究进展

综合评述了近年来植物几丁酶的结构与功能、基因表达和调节、录译后加工及分类研究方面所取得的进展．植物几丁酶前体均含Ｎ－端信号肽和催化区，有的还有几丁质结合区和Ｃ－端液泡导向区；植物几丁酶绝大多数可由病原物等生物因素或乙烯等非生物因素诱导，并有组织专化性，有些受发育调节；译后几丁酶前体切除Ｎ－端信号肽→脯氨酸羟基化→切除Ｃ－端信号肽而成为成熟蛋白；几丁酶的分类目前存在两个系统，分别将几丁酶分为５类（ｃｌａｓｓ）或将几丁酶基因分４组（ｇｒｏｕｐ）．

高等植物几丁酶研究进展

几丁醇是一种分解聚N—乙酰胺基葡萄糖分子的糖苷酶,普遍存在于自然界。高等植物中,几丁酶虽然普遍存在,但迄今没有发现底物。因此,高等植物几丁酶的功能是个十分吸引人而又研究不多的问题。本文介绍高等植物几丁酶的分布、酶学性质,基因结构和可诱导性等研究结果。并介绍了几丁酶在植物抗真菌病中的作用的研究进展。

苦瓜叶片几丁酶的纯化

利用亲和层析和Sephadex G-200柱层析纯化了苦瓜的几丁酶。纯化后的几丁酶在SDS聚丙烯酰胺凝胺胶电泳中为单带,分子量为35KD,表现内切酶活性,外切酶活性很弱。

香蕉采后炭疽病发生与几丁酶、β-1,3-葡聚糖酶和多巴胺的关系

几丁酶、β－1，3-葡聚糖酶随着香蕉术后炭疽病的发展过程，活性逐渐增加；但当果实出现明显病害症状时活性略有下降。施保功处理在抑制香蕉采后炭疽病发生的同时也抑制了芭蕉炭疽菌可能诱导的几丁酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的增加。多巴胺在香蕉采收时含量较高，但随着炭疽病的发生明显下降。对“黑油身”和“63－1”两个不同抗病品种分析表明，前者几丁酶和β－1，3-葡聚糖酶活性和多巴胺含量较高与其较强的抗病性相一致。

黄瓜几丁酶活性与其对枯萎病抗性的关系

黄瓜枯萎菌［Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ （Ｓｃｈｌ．） ｆ．ｓｐ． ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ Ｏｗｅｎ］能诱导黄瓜几丁酶的积累，但在诱导的速度和强度上，抗病品种和感病品种有明显的差异。抗病品种“津杂四号”积累的幅度远大于感病品种“津研四号”，升高的幅度是“津研四号”的２．８倍。因此我们可以初步认为几丁酶与黄瓜对枯萎病的抗性反应有关。

香蕉采后炭疽病发生与几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶的关系

几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶普遍存在于植物体内,但迄今未在植物中发现有几丁质存在。植物中几丁酶提取液能高度抑制真菌的生长,而β-1,3-葡聚糖酶能起协同作用。推测几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶可能与植物的抗病性有关。为此,本文选择了香蕉不同抗病品种作为材料,分析了果实采后炭疽病发生与几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶之间的关系。 1 试验材料 供试香蕉品种为“黑油身”和“63-1”(前者较为抗病)。果实采收后经自来水冲洗干净、室温自然晾干后。

脱乙酰几丁质的制备及其对细胞透性和脱乙酰几丁酶活性的影响

虾壳经盐酸和氢氧化钠处理，高锰酸钾漂白，制得几丁质，几丁质经５０％ＮａＯＨ处理，获得脱乙酰几丁质，制得的脱乙酰几丁质能溶于３％醋酸中。植物离体叶片经不同浓度脱乙酰几丁质处理，用电导法和染料结合法，分别测定细胞中电解质和蛋白质的外渗量，用分光光度法测定脱乙酰几丁酶的活性。结果表明，脱乙酰几丁质能使多种植物电解质的外渗量增加，脱乙酰几丁质的浓度愈大，处理的时间愈长，则外渗量增加愈显著。易染赤霉病的小麦品种比抗赤霉病的小麦品种，叶片电解质的外渗量增加。外渗量的增加与脱乙酰几丁质的浓度及处理的时间有关。叶片中蛋白质的外渗与电解质的外渗情况相似，易染病的品种比抗病的品种，蛋白质的外渗量增加７０％－８０％。脱乙酰几丁质处理，使抗病品种叶片中脱乙酰几丁酶的活性增加４０％－６０％。在同样条件下，不抗病品种酶的活性变化不大。文中对所得结果与植物抗病性之间的关系进行了讨论。