凤仙花坏死斑病毒在中国的适生性风险评估

凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)能够侵染多种花卉并破坏其观赏价值,目前在我国已有INSV的入侵报道。查询INSV和西花蓟马在世界范围内报道的地理信息,应用MaxEnt、ArcGIS软件,分别获得INSV和西花蓟马的适生性范围,结合INSV植物寄主在Lifemapper发布的分布数据,获得INSV中国境内风险发生区分布图。预测结果显示我国华东地区、中南地区、华北部分省份、西南部分省份及西北部分省份,都是潜在INSV高风险发生地区,包括了云南、贵州、广西、广东、福建、湖南、湖北、江西、浙江、台湾、上海、江苏、安徽、山东、陕西、山西、河南、河北、北京、天津、重庆、四川东部、甘肃部分地区、辽宁部分地区。INSV入侵中国的适生性分布评估将为INSV的检疫及防控提供参考。

盆栽文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的检测与分子鉴定

应用酶联免疫吸附检测法(ELISA)和RT-PCR技术从表现有同心圆褪绿斑的进境盆栽文心兰上检测出凤仙花坏死斑病毒。ELISA检测发现该病毒在文心兰上分布不均匀,病毒主要集中在表现症状的病斑处。同时,根据该病毒SRNA上的核衣壳蛋白(N)基因序列保守区设计了一对特异性引物,利用RT-PCR方法检测得到500bp的预期DNA片段。经HindIII和EcolI酶切验证后克隆了该序列片段,序列分析结果表明该病毒的N基因序列和已经发表的凤仙花坏死斑病毒(登陆号为AB109100、AB207803、DQ425096)核苷酸序列同源性为99%,进一步确认进境盆栽文心兰上携带凤仙花坏死病毒。这是INSV首次在中国的报道,也是第一次在文心兰上发现该病毒。

凤仙花坏死斑病毒的RT-PCR和巢式PCR检测

根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot tospovirus,INSV)S RNA上的核衣壳蛋白(N)基因序列(登录号为AB109100)保守区设计了3对特异性引物。应用常规RT-PCR和巢式PCR方法从表现同心圆症状的文心兰植株上检测得到了预期DNA片段,且巢式PCR检测灵敏度比常规PCR高。序列分析结果表明,该病毒的N基因序列和已经发表的凤仙花坏死斑病毒(登录号为AB109100、AB207803、DQ425096)核苷酸序列同源性为99%,确定表现同心圆症状的文心兰上携带了凤仙花坏死斑病毒。

兰花上凤仙花坏死斑病毒和建兰花叶病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)和建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)的保守序列设计特异性引物,建立了双重RT-PCR同时检测两种病毒的方法。用该方法对兰花基地的可疑发病兰株进行检测,结果从田间采取的12株可疑兰花中有6株检出INSV,1株检出CyMV,2株同时检出两种病毒。

3种番茄斑萎病毒属病毒侵染寄主植物的细胞病理特征

应用超薄切片电镜观察,对3种番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒侵染寄主细胞病理特征进行了比较分析。番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot viru,s TZSV)侵染的番茄,叶部细胞中病毒粒体呈块状聚集于内质网池中,果实细胞中呈块状、管状或单个粒体散布于细胞质中,细胞核较完整,叶绿体空泡化;凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)侵染的蝴蝶兰叶部细胞和亚细胞结构消失,病毒粒体分布较少,聚集于细胞质中的内质网池内;花生黄斑病毒(Groundnut yellow spot viru,s GYSV)侵染的辣椒果实的亚细胞结构较完整,病毒粒体呈块状聚集于细胞质的囊腔内。研究结果表明,不同种类的Tospovirus病毒侵染寄主植物后,其病毒粒体在寄主细胞内的分布、聚集方式及对亚细胞结构的影响具有明显差异,可作为诊断的依据。

云南省蝴蝶兰上凤仙花坏死斑病毒的鉴定

2008年对云南省主要花卉基地进行调查,获得症状表现为环斑、坏死,疑似番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒的蝴蝶兰样品。应用生物测定,结合现代电镜技术、免疫试纸条检测技术初步确定为番茄斑萎病毒属的凤仙花坏死斑病毒(Impaliens necrotic spot virus,INSV),通过设计的4对引物进行RT-PCR扩增和测序,获得核壳体蛋白(Nucleocapsid protein)基因核酸长度为886nts,RNAM编码的非结构蛋白(Nonstructure protein,NSm)基因核酸长度为681nts,依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因核酸长度为1048nts,测序结果在NCBIBLAST网络数据库中比对,同时应用生物信息软件DNAman比对,其与INSV的同源性都达90%以上,都证明分离到的病原物为凤仙花坏死斑病毒(INSV)。

3种番茄斑萎病毒属病毒多重RT-PCR检测方法的建立

利用LaserGene软件对Genbank数据库中已登陆的番茄斑萎病毒(TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(INSV)和鸢尾黄斑病毒(IYSV)全基因组序列进行比对,选择最保守的区域,设计3种病毒的特异性引物,通过逐步调整优化PCR的反应条件,建立了多重RT-PCR检测TSWV、INSV和IYSV的技术体系。结果表明:可从约16μg的带毒烟草叶片中同时检测到3种病毒,具有较高的特异性和准确性。该方法可以同步、快速、特异地检测出受侵染寄主植物中的TSWV、INSV和IYSV。