建立一种EGFR突变检测的凸环引物荧光PCR新方法

目的建立一种能快速、有效检测EGFR突变的凸环引物荧光PCR新方法。方法同时用凸环引物荧光PCR技术法和Sanger测序法对混有不同比例的EGFR突变型质粒的样本进行对照检测,以对比两者灵敏度;采用两种方法对93例肺癌组织的EGFR基因进行热突变位点E746-A750del和L858R的检测,并统计其符合率。结果在93例肺癌组织的DNA中,凸环引物荧光PCR技术法和Sanger测序法检测到EGFR突变分别为29例(E746-A750del 15例,L858R14例)和28例(E746-A750del 15例,L858R 13例),符合率达96.6%,且凸环引物荧光PCR技术法能检测出混有5%突变质粒型的样本,其灵敏度达5%,比Sanger测序法高。结论凸环引物荧光PCR技术法比测序法更为简便,且灵敏度更高,易于实现,2小时内即可得出准确结果。

Taqman实时荧光定量PCR快速检测白斑综合症病毒的方法研究

目的:建立一种快速、特异、灵敏的实时荧光定量PCR方法用于检测白斑综合病毒DNA,为控制对虾白斑综合症提供科学依据。方法:根据GenBank登录的白斑综合病毒株序列,使用生物学软件进行序列对比,在白斑综合症病毒保守区序列设计引物和Tagman探针并进行筛选。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化,提高了该方法的特异性、灵敏度和重现性等,并与标准方法(核酸探针点杂交)进行比对,对现场32份虾样进行了检测。结果:Tagman实时荧光定量PCR与标准方法的特异性符合率为100%,灵敏度超过标准方法的10000～100000倍,检测时间为标准方法的1/24,重现性良好(s=0.1～0.49,CV=0.78%～3.72%),并能准确定量。结论:本研究建立的Taqman实时荧光定量PCR方法用于白斑综合症病毒检测具有特异、灵敏、快速、定量、重现性好等优点。

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。

口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速、高效、敏感、特异地检测口蹄疫病毒（FMDV）的一步法荧光定量RT—PCR检测方法。方法根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果，设计特异性引物和MGB探针；通过优化，得到最佳反应体系和反应条件；分别以质粒和病毒RNA为模板，构建标准曲线；并进行特异性、敏感性、重复性试验。

鸭疫里默氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法建立

为建立鸭疫里默氏杆菌（RA）定量检测方法，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的研究人员根据RA的铁依赖抑制子基因（RaDtxR）序列，设计特异性引物和探针，建立基于TaqMan探针检测RA的荧光定量PCR方法。

鸭疫里默氏杆菌荧光定量PCR检测方法建立

华南农业大学冯金牛等根据鸭疫里默氏杆菌（RA）16SrlKNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。试验结果显示，该方法具有良好的特异性，DNA拷贝数在108～108范围内检测曲线有良好的线性关系，对质粒标准品的最低检测限为1．0x10^1copies／μL，重复性检测的变异系数低于5％，利用该方法分别对自然感染表现典型鸭疫里默氏杆菌临床症状和病理变化的死亡雏鸭肝、心、脑组织等不同脏器进行细菌定量检测，阳性率均为100％，而用普通PCIK检测阳性率分别只有72％、84％和92％。证明该研究所建立的荧光定量PCR方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点，可用于RA感染的快速诊断、流行病学调查以及鸭产品的检疫。

五重实时荧光PCR检测方法的建立分析

针对狐狸、水貂、貉子和狗源性成分进行具体的分析,并针对其特异性引物以及探针进行相应的研究,从而针对其自身的体质来进行相应的产品进行挑选,为了更好的检测狐狸、水貂、貉子和狗针对荧光PCR反应体系以及反应条件来进行相应的筛选,从而更好地突出狐狸、水貂、貉子和狗各自的特异性,选择与自身属性相符的产品来进行相应的实时荧光PCR检测。

快速检测A型流感病毒的Taq Man实时荧光定量RT—PCR方法的建立

根据A型流感病毒基质蛋白（matrix protein，M）基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqManBHQ探针，建立快速检测A型流感病毒的实时荧光定量RT—PCR方法。通过RT—PCR方法克隆A型流感病毒M基因靶序列并将其连入pMD-1ST载体，制备阳性标准品，优化反应条件，以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线，其相关系数为0．998。

转基因烟草荧光定量检测方法研究

依据实时定量PCR原理,参照35S启动子、NOS终止子、GUS基因和NPTII基因序列设计TaqMan引物和荧光标记探针。采用美国MJ公司OpticonTM2荧光定量PCR检测系统对烤后烟叶进行转基因定量检测技术研究,从中筛选出扩增效率高,灵敏度好的PCR引物和探针序列,同时通过对扩增体系,扩增条件的梯度实验,优化出荧光定量检测的最佳反应体系和反应条件,从而建立了转基因烟草定量检测方法。该方法经验证其检测灵敏度达到0.05％。在2003年6月参加CORESTA(国际烟草科研与合作中心)组织的国际烟草转基因定量检测合作试验中,该优化转基因烟草定量检测技术获得了较好成绩,对盲检样品检测结果评价(Z-score)列国际12家实验室之首,证明此法灵敏度高、稳定性好。

STR基因座荧光标记复合扩增检测及其法医学应用

目的建立荧光标记复合扩增检测4个STR基因座的方法,应用于法医学亲权鉴定与个人识别。方法用6-FAM标记D3S1754引物,HEX标记D4S2366和D12S375引物,TMR标记D1S549引物,PCR复合扩增,310基因分析仪电泳自动收集电泳结果数据,GeneScanAnalysisSoftware3.7NT计算扩增产物片段相对大小,Genotyper誖3.7NT软件进行样本基因型分型。将该方法应用于法医学亲权鉴定与个人识别。结果建立了荧光标记复合扩增检测4个STR基因座基因型的方法,具有良好的稳定性和较好的灵敏度,分型结果准确。结论研究建立的方法操作简便,分型结果稳定可靠,可用于遗传多态性研究和法医学亲权鉴定与个人识别。

多对沙眼衣原体引物敏感度的比较

沙眼衣原体(CT)检测方法很多,有Moccy细胞培养方法、直接涂片荧光抗体法、酶免疫法、探针杂交和PCR技术等.临床实验证明PCR技术敏感、特异,但敏感度也受标本收集、引物选择等多种因素的影响,本研究主要比较设计不同引物序列对PCR检测敏感度的影响.

TP-M13自动荧光检测法在高粱SSR基因型鉴定中的应用

研究利用TP-M13自动荧光检测法对48份高粱材料进行了简单序列重复(SSR)标记的基因型鉴定。在这个方法中,需要合成一个普适性的用荧光(如FAM)标记的M13引物,并把M13的正向引物和一个SSR反向引物相连(称为TP-M13引物),利用3条引物序列进行PCR扩增,其PCR产物在DNA测序仪(如ABI3700仪)上进行自动荧光检测。结果表明,这种方法和其他的传统方法相比,具有经济、灵敏、高效的优点。建议在利用数量很多的SSR标记对数量有限的基因组较小的材料进行基因型鉴定时,使用TP-M13自动荧光检测系统。

甲型流感病毒荧光RT-PCR检测方法的设计和检定

目的 设计甲型流感病毒TaqMan荧光RT-PCR检测方法并对其进行检定。方法 用DNAStar和PrimerPremier5. 0软件设计甲型流感病毒荧光PCR检测所用引物和探针 ;在GenBank中进行Blast以及电子对比证明其具有高度的特异性和保守性 ;和标准RT-PCR进行比较 ,检测此方法的灵敏度。结果 所设计的引物和探针高度特异和保守 ,灵敏度比标准RT-PCR方法高 3～ 27倍 ,并且反转录和PCR可合并为一步。结论 设计了甲型流感病毒TaqMan检测方法 ;该方法具有特异。

实时荧光定量PCR方法检测小RNA

Real—time Quantitative PCR Detecting System，即实时定量核酸扩增检测系统，也称为实时定量基因扩增检测系统，简称定量PCR（qPCR）。荧光定量PCR-般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量PCR（以SYBRGreen I为例）方法对小RNA进行定量分析。SYBRGreen I qPCR分析小RNA的优点为：实验设计简单，一般需要一条特异性反转录引物，一条特异性正向PCR引物，反向PCR引物可通用于所有小RNA分析，无需象TaqMan方法那样专门设计探针；实验成本相对较低；可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术，而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下：

TaqMan-MGB探针在小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌鉴定上的应用

根据小麦印度腥黑穗病菌Tilletiaindica和黑麦草腥黑穗病菌T .walkeri核糖体ITS序列设计了两对通用引物和两条特异性探针 ,建立了小麦印腥印度腥黑穗病菌Tilletiaindica和黑麦草腥黑穗病菌T .walkeri的实时荧光PCR检测方法 ,检测的灵敏度为 1个冬孢子。这种检测方法可以直接用于样品小麦印腥和黑麦草腥黑穗病菌冬孢子的快速检测 ,整个检测过程缩短至 1天。

简套式荧光RT-PCR检测患者血清样本中SARS冠状病毒

目的 建立一种快速、特异、灵敏的SARS冠状病毒(SARS CoV)核酸检测方法。方法 根据GenBank中SARS CoV基因序列,自行设计引物、荧光探针,在PE 770 0扩增仪上探讨工作参数,形成试剂盒,并用研制的试剂检测76份临床SARS样本。结果 简套式荧光RT PCR方法对血清样本、漱口液样本、正常人样本检出率分别为33.3% (12 36 )、6 7.5 % (2 7 4 0 )、0 (0 / 16 0 ) ,与经典套式检测结果一致。而传统一步法荧光RT PCR对样本的检出率分别为13 9% (5 36 )、5 2 5 % (2 1 4 0 )、0 (0 / 80 )。结论 简套式荧光RT PCR核酸检测法是SARS临床早期诊断快速、特异、灵敏的方法。

SNaPshot技术检测乙型肝炎病毒基因组P基因区单核苷酸多态性的研究

目的 建立SNaPshot技术对乙型肝炎病毒(HBV)基因组P基因区单核苷酸多态性(SNP)的分析。方法 针对HBVYMDD变异位置的上、下游设计引物,用PCR方法进行DNA扩增,产物直接测序或克隆测序。再针对变异位点74 1A G变异型(YVDD)和74 3G T变异型(YIDD)的紧邻上游设计高度特异的SNaPshot检测引物,用不同荧光标记的ddNTP对PCR产物进行一步延伸,然后置于310型DNA测序仪上观察荧光信号,可直观的检测上述两位点的单核苷酸多态性。结果 在拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者中,经测序证实P基因区不仅存在74 1、74 3位点的变异,还存在5 14C A、5 2 3C A、5 6 2T A、6 6 7C A等位点的变异。对已证实P基因区变异的13例患者血清用SNaPshot技术检测YMDD结果与测序结果完全相同,显示SNaPshot技术高度的特异性。结论 SNaPshot技术检测HBV基因组SNPs具有快速、简便、准确特异的特点,还检测到野生株和变异株的混合存在。

基因芯片检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7

目的设计和制备快速、特异、灵敏的检测大肠埃希菌O157∶H7基因芯片。方法选择O157∶H7特异的rfbE、fliC、SLT1和SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次聚合酶链反应(PCR)扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157∶H7菌株和非O157病原体。结果O157∶H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高。结论基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157∶H7,为建立快速灵敏的检测细菌病原体和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法。