出芽短梗霉菌PA−2侵染对藜叶片代谢的影响

为探明出芽短梗霉菌Aureobasidium pullulans PA−2侵染对藜Chenopodium album叶片代谢影响,采用基于液相色谱−质谱联用技术(LC−MS)的代谢组学方法,对出芽短梗霉菌PA−2侵染藜叶片差异代谢产物进行分析。结果表明,通过正交偏最小二乘法判别分析(OPLS−DA),PA−2孢子处理藜叶片24 h后和处理前两组共筛选到185个具有显著差异(VIP>1,P<0.05)的代谢产物,其中有148个上调,37个下调,腺苷和甜菜碱可以作为24 h后的主要生物标志物。KEGG通路富集分析发现,这些差异代谢物主要富集在全局和概述地图、氨基酸代谢、碳水化合物代谢通路等3条代谢通路中。藜叶片中嘌呤代谢、次级代谢产物生物合成、氨基酸代谢和碳水化合物代谢变化可能是PA−2侵染藜的主要机制。本研究为进一步研究出芽短梗霉菌侵染藜的生防机制提供了理论基础。

出芽短梗霉菌株PA-2胁迫下藜qRT-PCR内参基因的筛选与验证

为筛选适合出芽短梗霉菌株PA-2胁迫下藜中稳定表达的内参基因,在转录组数据(NCBI登录号为:SRA:SRR12674257)分析的基础上,以PA-2不同时间胁迫的藜叶片为材料,分析藜中ACT-1、TUB-1、GAPDH、eEF1α、eIF3、UBQ、PTB、COX10、UPL6、TIP41L、RAN-B1和IDH-5等12个内参基因的表达水平,并利用ΔCt、GeNorm、NormFinder、BestKeeper及RefFinder分析候选内参基因的表达稳定性。结果表明,内参基因COX10是PA-2不同时间胁迫下藜中最稳定的内参基因,最优组合是COX10+eEF1α。通过分析藜ACC基因的相对表达水平,验证了内参基因的可靠性,为今后杂草藜胁迫响应基因的表达分析提供了参考基因和理论依据。

藜叶片响应出芽短梗霉菌侵染内参基因筛选及光合作用相关基因表达分析

【目的】筛选适合出芽短梗霉菌株PA-2侵染藜的稳定表达的最适内参基因,并进行PA-2侵染下藜光合作用相关基因的表达分析验证。【方法】分别以菌株PA-2孢子侵染0、1、3、5、7 d的藜叶片和正常生长藜的根、茎、叶为供试材料,通过qRT-PCR技术和Ct值评估3个候选内参基因GAPDH、β-ACTIN、β-TUBULIN的表达稳定性,并利用筛选出的内参基因,对藜光合作用相关基因(LFRN、MDH、PetC、psaA、CAB40、psaN、BHY和MO_(2))的表达水平进行定量分析。【结果】在菌株PA-2侵染藜不同时间点和不同组织的样本中,藜最适内参基因为GAPDH,可用于后续分析光合作用相关基因的表达水平。以GAPDH作为内参基因检测8个光合作用相关基因的表达水平,在不同侵染时间点,8个光合作用相关基因的表达量均出现不同程度的下调,除MDH基因外,其余基因均在5 d时达到最低水平。其中PctC、psaN、CAB40、BHY、MO_(2)基因在藜受侵染0~1 d中下调表达,在3 d达到较高水平,后期表达量下调;pasA先上调表达后下调表达;LFRN在受侵染后持续下调表达;MDH在受侵染后先显著下调,在3 d达到较低水平,后上调表达。在藜受侵染的不同组织中,8个基因在藜叶中均有大量表达,其中MDH基因在茎中大量表达,PctC和CAB40在根中表达量最低,除MDH基因外,其余7个基因在不同组织中的表达量高低排序为:叶>茎>根。【结论】本研究为后续利用qRT-PCR分析藜基因表达及研究PA-2致病机理奠定基础。

出芽短梗霉菌菌株PA-2的除草活性及对作物的安全性

从青海省平安县发病杨树叶片上分离得到菌株PA-2,其发酵滤液对多种阔叶杂草表现出较好的除草活性。对该菌株的培养特征和16S rDNA基因序列分析后,确定其为短梗霉属出芽短梗霉菌Aureobasidium pullulans。盆栽试验表明,其发酵滤液对供试阔叶杂草猪殃殃、藜、冬葵、酸模叶蓼及禾本科野燕麦的鲜重防效分别达到87.25%、78.46%、82.25%、62.11%、80.27%。作物安全性试验结果表明,其发酵滤液对小麦、蚕豆、青稞很安全,对油菜、豌豆有轻微影响。综上所述,菌株PA-2具有作为微生物除草剂的开发潜力。

出芽短梗霉菌PA-2发酵培养基及发酵条件优化

【目的】优化出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)PA-2菌株产孢发酵培养基和发酵条件,以提高PA-2菌株的产孢量,为该菌的开发和生产应用提供理论依据。【方法】以PA-2菌株发酵液中的产孢量为检测指标,采用单因子优化PA-2菌株发酵培养基和最佳发酵条件,通过中心组合设计(Central composite design,CCD)筛选培养基成分最佳配比;用PA-2菌株制成可湿性粉剂用于杂草藜田间防除试验。【结果】经优化后,PA-2菌株产孢最佳培养基配方为葡萄糖84.60 g/L、大豆粉46.35 g/L、NaCl 2.59 g/L、MgSO4 0.52 g/L、KCl 0.78 g/L、K2HPO4 6.50 g/L、(NH4)2SO4 0.52 g/L;最佳发酵条件为pH 7、温度25 ℃、装液量60 mL/250 mL、转速180 r/min、接种量8%、培养时间120 h。田间防除试验结果表明,PA-2可湿性粉剂对杂草藜的鲜重防效最高可达75.0%。【结论】优化后的培养和发酵条件可有效提高PA-2菌株的产孢量,降低发酵成本,适合发酵放大试验及相关剂型的开发研究;可采用PA-2菌株生产菌剂应用于杂草防除。

出芽短梗霉菌PA-2脂肽类物质抑菌活性及其发酵条件优化

探究出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)PA-2脂肽类物质的抑菌活性,并以脂肽类物质的产量为响应值对其发酵条件进行优化,为脂肽类物质的生产与应用奠定理论基础。采用酸沉淀法对脂肽类物质进行粗提,通过原位酸水解-茚三酮显色法对脂肽粗提物进行定性检测,并用琼脂打孔扩散法对其抑菌活性进行测定,通过中心组合设计(central composite design,CCD)构建响应面对其发酵条件进行优化。最终初步判定粗提物为环状脂肽类物质;该物质对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、樱桃球腔菌(Mycosphaerella cerasella)和大麦网斑病(Pyrenophora teres)具有明显的抑制作用,抑菌圈分别为3.65、1.95、2.15、1.35、2.18 cm;优化后的最适发酵条件为:接种量6.8%、转速216 r·min^(-1)、温度26℃、装液量125 mL、pH 7。在此条件下模型预测的脂肽类物质产量为0.94 g·L^(-1),实际为0.92 g·L^(-1),比优化前的产量(0.61 g·L^(-1))提高了51%。优化后的发酵条件可提高脂肽类物质产量,降低发酵成本,可用于上述有抑制效果的菌株防治。

出芽短梗霉菌PA-2对藜叶片生理生化的影响

为明确出芽短梗霉菌PA-2侵染对藜叶片生理生化代谢的影响,通过试剂盒法测定了对照组(CK)、盆栽试验组及田间试验组藜叶片保护酶、丙二醛、叶绿素、可溶性蛋白和可溶性糖含量,电镜下观察了藜叶片细胞超显微结构的变化。结果表明:相对于CK,盆栽组和田间组藜叶片内叶绿素、可溶性蛋白质、可溶性糖含量以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在PA-2侵染下呈现总体下调趋势;在接种第3天,观察到藜细胞内叶绿体形状畸形,胞内结构不完整、外膜逐渐解体。本研究为解析出芽短梗霉菌PA-2对藜侵染的分子机理提供参考。

出芽短梗霉对苹果采后灰霉病的防治

通过稀释平板法和离体果实接种法从苹果表面分离筛选到1株对苹果采后灰霉病Botrytis cinerea具有显著防治效果的酵母菌株2SP,该酵母菌孢子悬浮液对苹果灰霉病的防治效果为78.45%,对灰霉菌孢子的萌发抑制率为90.0%,而过滤上清液和离心灭菌上清液对灰霉病菌防治效果较差,表明营养和空间竞争可能是该酵母菌抑制灰霉病发展的主要机制。该酵母菌在苹果伤口接种后置于4℃低温条件下,30 d后仍能存活,且酵母菌的数量高于起始值。通过26S rDNA D1/D2序列分析,将该酵母菌株初步鉴定为出芽短梗霉Aureobasidium pullulans。

出芽短梗霉新菌株RM1603产普鲁兰多糖条件优化及多糖分析

目的:出芽短梗霉RM1603是一株高产胞外多糖新菌株,通过优化其产糖条件,鉴定其多糖结构,为进一步开发利用RM1603产胞外多糖奠定理论基础。方法:以RM1603为出发菌株,在单因素分析确定最佳氮源与无机盐的基础上,利用正交试验探究RM1603最佳发酵产糖条件;薄层层析及红外光谱分析确定胞外多糖产物结构。结果:出芽短梗霉菌RM1603的初始多糖产量为28.91g/L,发酵条件优化后产糖量达到65.213g/L,提高了约2.3倍;结构分析表明RM1603的多糖产物为普鲁兰多糖。结论:出芽短梗霉RM1603是一株具有较大产糖优势,极具开发潜力的高产普鲁兰糖新菌株;奠定了开发利用RM1603生产普鲁兰多糖的理论基础。

出芽短梗霉菌株PA-2侵染藜叶片的转录组分析

藜(Chenopodium album)是一种极具竞争力的一年生世界性杂草。为了探究出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株PA-2侵染藜的分子机制,利用RAN-seq技术分析PA-2侵染藜叶片0 (CK)、1 (T1)、3 (T3)、5(T5)、7 (T7) d的转录组差异。基于转录组数据组装,共得到69 404条Unigene,其中50.13%的序列在KEGG、NR、COG以及SwissProt四大数据库中得到注释。利用GO数据库对差异表达基因进行分析,结果发现差异表达基因主要富集在质体、类囊体、叶绿体、细胞膜以及氧化还原酶活性等方面。利用KEGG数据库对差异表达基因影响的通路进行注释后发现,PA-2侵染主要影响了植物MAPK信号通路、植物病原体相互作用、苯丙烷生物合成和植物激素信号转导等途径中关键基因的表达水平。经PA-2处理后,通过转录组测序筛选出与叶绿体相关的差异基因主要集中在光系统Ⅱ(PSⅡ),分别是psbY、psbB以及psbO基因,其次是与碳固定过程紧密相关的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPB)和果糖二磷酸醛缩酶(FBA3)的基因,影响叶绿体膜流动性的乙酰辅酶A羧化酶(BCCP1)以及影响可溶性糖含量的葡聚糖水二激酶(GWD1)。研究结果初步明确了菌株PA-2防除藜的分子机制,为PA-2生物除草制剂商品化以及杂草的生物防治奠定一定的理论基础。

筛选出芽短梗霉生产低聚果糖探究溶氧的影响

目的:从土壤树叶中筛选出芽短梗霉菌和实验室已有的出芽短梗霉,探究出芽短梗霉菌产低聚果糖的发酵性能。方法:对筛选的出芽短梗霉菌和实验室保存的出芽短梗霉菌进行发酵,通过高效液相色谱法测定得出最佳菌株,改变溶氧发酵条件探究对发酵产低聚果糖的影响。结果:通过筛选和发酵,筛选出产低聚果糖最高的出芽短梗霉菌IPE-3。结论:IPE-3是一种优秀的产低聚果糖的菌株,在600 r/min、1.8 L/min通气量和0 bar条件下,低聚果糖的产量高。

出芽短梗霉菌株PA-2全基因组测序及分析

【背景】出芽短梗霉菌株PA-2是一株分离自青海省海东市平安区患病杨树叶片上的真菌,前期研究表明该菌株具有除草和抑菌能力,说明其在生物农药方面具有潜在的应用前景。【目的】了解菌株PA-2的基因组序列信息,挖掘其生防相关功能基因簇,为进一步研究解析该菌株生防机理及生防功能改造提供遗传背景信息。【方法】利用IlluminaHiSeq高通量测序平台对生防菌株PA-2进行全基因组测序,用生物信息学的方法对测序数据进行基因组组装、基因预测及功能注释、碳水化合物活性酶预测、次级代谢产物合成基因簇预测,利用刚果红染色等方法对水解酶活性进行衡量。【结果】菌株PA-2基因组序列全长28932793 bp,平均GC含量为50%,共编码10839个基因,预测到该菌株具有4个已知的次级代谢产物合成基因簇,编码Melanin、Burnettramic Acid A、ACR-Toxin I、Abscisic Acid,该菌株能水解纤维素和果胶。【结论】有助于在基因组层面上解析菌株PA-2生防机制的内在原因,为深入了解出芽短梗霉菌次级代谢物合成途径提供参考,对菌株PA-2的下一步相关研究具有重要意义。

响应面法优化β-聚苹果酸发酵培养基的研究

采用响应面法对出芽短梗霉菌发酵制备β-聚苹果酸的培养基进行优化。使用Plackett-Burman(P-B)实验设计对培养基中相关因素进行评价,筛选出有显著影响效应的因素。通过最陡爬坡实验、中心复合实验设计及响应面分析确定主要影响因素的最佳浓度及回归模型,并经实验验证模型的可行性。优化后三种显著影响因素:葡萄糖、丁二酸铵和碳酸钙,最佳浓度分别为:110.91、3.66、45.30g/L,β-聚苹果酸的发酵产量达到41.36g/L,较优化前的20.74g/L提高了199%。

生物催化不对称还原方法生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

通过筛选得到不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)对映选择性好的微生物菌株出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)SW0202.对其还原反应条件进行优化,得到最佳转化条件为:初始细胞浓度0.32g/mL(以湿菌体计),底物浓度20g/L,pH7.0,温度30℃.在此优化条件下,产物浓度达20.32g/L,摩尔转化率为79.6%,产物对映体过量值e.e.为97.8%.分批添加底物可显著减小底物的抑制作用.

基于代谢组学分析MgSO_(4)·7H_(2)O和K_(2)HPO_(4)协同对普鲁兰多糖生物合成的影响

基于代谢组学技术中的气相色谱-质谱法(Gas chromatography mass spectrometry,GC-MS),研究MgSO_(4)·7H_(2)O和K_(2)HPO_(4)对出芽短梗霉产普鲁兰多糖的影响。结果表明:在基础培养基中分别添加0.76 g/L MgSO_(4)·7H_(2)O或8.58 g/L K_(2)HPO_(4)均不能提高普鲁兰多糖的产量,但同时添加0.76 g/L MgSO_(4)·7H_(2)O和8.58 g/L K_(2)HPO_(4)时,产量由65.2 g/L提高至133.1 g/L;同时,胞内磷酸葡萄糖变位酶(Phosphoglucose mutase,PGM)和葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase,GTF)的活性显著提高,而尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(Uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase,UDGP)活性并没有明显差异。通过GC-MS分析发现,胞内阿拉伯醇、甘油浓度提高,D-半乳糖、D-果糖和丙氨酸等9种代谢物浓度下降;进一步分析可知,MgSO_(4)·7H_(2)O和K_(2)HPO_(4)加强了戊糖-葡萄糖醛酸转换途径、丙氨酸、精氨酸和谷氨酸代谢、果糖、甘露糖代谢和半乳糖代谢途径,为菌体生长及普鲁兰多糖合成提供了更多能量和前体物质。

腐蚀法制备碳化硅量子点标记材料及其光学性能

以硝酸和氢氟酸为腐蚀液对自蔓延燃烧合成的纳米均质碳化硅颗粒进行腐蚀，而后进行超声空化破碎分散及高速离心处理，获得无细胞毒性的碳化硅量子点标记材料，对其微观结构的演变过程及光学性能进行检测，对出芽短梗霉菌（Aureobasidium pulluans）活体细胞进行标记并长时程荧光成像。结果表明，自蔓延合成的SiC粉体颗粒极易腐蚀成网格状镂空结构，超声空化破碎及高速离心层析剪裁后获得尺寸高度单分散的碳化硅量子点（约为1～2.5nm），小于体材料的激子Bohr直径（5.4nm），会产生强烈的光致发光效应。活体细胞标记及荧光成像结果表明，腐蚀法制备出的碳化硅最子点具有较高的生物相容性，同时对其标记及长时程荧光成像原理进行了初步探讨。

小鼠胃类器官培养中真菌污染的鉴定与控制

目的探讨小鼠胃类器官培养过程中污染真菌的种类及其控制措施。方法利用小鼠胃成体干细胞培养胃类器官;分离小鼠胃类器官培养过程中产生的污染物,革兰染色观察镜下形态;将污染物分离培养,并进行真菌ITS基因测序分析;梯度浓度试验探究可抑制污染物的药物及最适浓度。结果小鼠胃类器官培养过程中的污染物为出芽短梗霉菌;500μg/L的两性霉素B可有效抑制污染的出芽短梗霉菌;控制真菌污染后成功构建小鼠胃类器官,第9 d时检测类器官仍具有活性。结论出芽短梗霉菌可引起小鼠胃类器官培养过程中的真菌污染,通过添加两性霉素B控制真菌污染可成功构建小鼠胃类器官。