食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测技术研究进展

近年来,因食源性致病菌造成的食品中毒正在不断增加,严重威胁了人类的健康,大肠杆菌(E.coli)O157∶H7由于其低感染剂量和高致病性等特点引起了研究人员和世界卫生组织的高度重视。因此精准快速的检测食品中的E.coli O157∶H7对食品安全问题有着重要的意义,是预防和控制食源性疾病传播的重要技术,为此本文对E.coli O157∶H7的常规检测方法、免疫学法、分子生物学法和其他方法进行论述,介绍了这些方法的优缺点,对各种方法进行了整体比较,以期为有关工作者在选择检测方法或研发新方法提供参考。

肠出血性大肠杆菌O157胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立一种简便实用的胶体金免疫层析检测方法用于食品样品中肠出血性大肠杆菌O157的快速筛查。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以抗EHEC O157 LPS单克隆抗体标记,以兔抗O157多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗夹心法,制成O157胶体金免疫层析检测试纸条,并进行了特异性和敏感性试验。结果该试纸条仅与O157反应,与其他受试菌株均不反应。检测敏感性为106CFU/mL,对人工污染EHEC O157模拟牛肉样品增菌后检测,敏感性为56 CFU/g。结论成功研制出EHEC O157胶体金免疫层析试纸条,敏感性高,特异性强,检测速度快,10min可出结果,操作简便,可用于现场大量样品的检测。

郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染监测

[目的]2005年监测郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染状况及病原分布特点,为各级卫生行政部门制订新发传染病防治措施,提供基础疫情资料。[方法]监测标本用免疫磁珠集菌方法(IMS)做病原学分离培养、毒力基因检测用多重PCR方法、药敏试验用(K-B)常规方法。[结果]腹泻病人标本185份,大肠杆菌O157:H7检出阳性4份。外环境标本588份,检出大肠杆菌O157:H7阳性20份。用多重PCR方法做毒力基因检测,有6份家畜家禽阳性标本中检出O157:H7毒力基因(Stx2、eaeA、HIyA)为阳性。药敏试验24株肠出血性大肠杆菌O157:H7对8种抗菌药物敏感率为95%以上,对新生霉素100%耐药,其余7种对抗菌药物敏感程度各有差异。[结论]郑州市有散在的大肠杆菌O157:H7感染的病人及动物疫点。奶牛和波尔山羊是大肠杆菌O157:H7动物宿主。

肠出血性大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌针对肠出血性大肠杆菌O157∶H7表面抗原的特异性单克隆抗体,以期用于该病原菌的检测。方法以敲除毒力基因的O157突变株F25全菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,分别以全菌抗原和热酚水法纯化的O157 LPS抗原用间接ELISA筛选能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定。结果建立了稳定分泌抗O157 LPS抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D6,分泌抗体属IgG3亚类,轻链为κ型。腹水抗体ELISA效价达1∶3.2×106。以辛酸/饱和硫酸铵法纯化后抗体效价为1∶1.6×106,亲和常数Ka大于6.14×10-11mol/L。用于协同凝集和间接荧光抗体试验具有良好的特异性。结论该单克隆抗体针对O157的LPS抗原,特异性强,亲和力高,可用于O157的检测或分离鉴定。

动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法。方法根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果该方法扩增目的基因片段分别为327bp、247bp、494bp、384bp和779bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104cfu/mL。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。

PCR-免疫胶体金试纸条方法检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的建立PCR-免疫胶体金试纸条法快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的分析方法。方法通过设计特异性引物建立肠出血性大肠杆菌O157:H7 PCR检测方法并使用免疫胶体金技术以及双抗体夹心法建立PCR产物快速检测试纸条并设计核酸检测展开液;将1株大肠杆菌O157:H7标准菌株和7株其他常见食源性致病菌作为试验菌株,用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度,并比较PCR-免疫胶体金试纸条法和PCR-琼脂糖凝胶电泳法的检测敏感度。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度,灵敏度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。结论本文建立的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好,灵敏度高,价格低廉,适用于食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测。

郑州市2005年肠出血性大肠杆菌O157:H7感染状况调查

目的:了解郑州市肠出血性大肠杆菌O157∶H7在腹泻病人中的检出情况和宿主动物带菌及毒力基因情况。方法:对采集的宿主动物和腹泻病人粪便及食品应用免疫磁珠富集分离法进行大肠杆菌O157∶H7分离和鉴定。结果:郑州市内共发现3例肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染病例,首次从腹泻病人中检出产毒O157∶H7菌株,采集5种以上动物粪便标本共计475份,从牛粪(247份)中分离到16株O157∶H7,检出率为6.48%,从羊粪(33份)中分离到3株O157∶H7,检出率为9.10%,并检出3株产毒O157∶H7菌株。采集5类市售食品共146份,未分离到O157∶H7。结论:郑州市存在发生肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染暴发或流行的潜在危险。

冷冻原肠中肠出血性大肠杆菌O157:H7的研究

目的检测分析进出境冷冻原肠携带肠出血性大肠杆菌O157∶H7的情况。方法对2010-2011年进境或国产的35份冷冻原肠样品(包括19份冷冻羊原肠和16份冷冻猪原肠)进行检测,根据细菌的培养特性、生化鉴定和血清学鉴定,同时设立标准菌株作为对照。结果 2份原肠样品检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7,检出率为5.71%。结论进境和国产原肠均有可能携带肠出血性大肠杆菌O157∶H7,应该加强监测。

出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体制备及免疫胶体金试纸条的研制

将骨髓瘤细胞SP2/0与出血性大肠杆菌O157∶H7免疫小鼠得到的脾细胞融合,通过筛选得到3株稳定分泌抗出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3、E7、B9,D3和B9亚类为IgG1,E7亚类为IgG2a,轻链亚型均为κ。交叉反应结果显示这3株单抗仅结合出血性大肠杆菌O157∶H7,对15株其他细菌无反应,测得胶体金标记单抗最佳pH、最佳结合量分别为D3:pH 7.5~8.0、24μg/mL;B9:pH 7.5、12μg/mL;E7∶pH7.5、18μg/mL,抗体配对选择胶体金结合D3喷涂金标垫、E7以1 mg/mL喷涂NC膜作T线为最优组合,试纸条检测出血性大肠杆菌O157∶H7灵敏度为2.1×106CFU/mL,且仅可检出出血性大肠杆菌O157∶H7,对25株其他细菌均无交叉反应,模拟带菌实验表明,对市售面包、牛奶、果冻各25 g(mL)均添加约200 CFU出血性大肠杆菌O157∶H7,增菌培养8、10、10 h即可检出。研究表明,实验自主制备的抗体性能良好,试纸条特异性、灵敏度达到国外同类产品,可在政府食源性致病菌监管部门、食品企业推广运用。

河南省出血性大肠杆菌O157:H7监测研究

目的 为了解河南省E .coliO15 7∶H7感染性腹泻的分布特征、临床特点以及在家畜、家禽中的带菌状况和食物污染程度。方法 采用O15 7特异性筛查方法进行病原体分离培养 ,应用分子生物学、微生物学、生物化学技术进行病人、家畜、家禽的病原菌分离、培养、毒素因子测定。结果 2 0 0 0 - 2 0 0 2年从 384 0份标本中检出E coliO15 7∶H72 2 0株 ,其中 77株具有毒素基因 ;显示有 5个毒素因子组合型。结论 病例有明显的时间、职业分布 ,发病以 6 0岁以上年龄组为主。最佳采样时间应在感染后 5天内。E coliO15

肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是食源感染的人兽共患病原菌。鞭毛蛋白(H7)是EHEC O157∶H7重要的毒力因子,其编码基因为flic。该研究在体外克隆和表达flic基因的可变区,并检测其免疫原性,旨在为EHEC O157∶H7疫苗的研制提供候选抗原。PCR扩增到flic基因538～1 483bp的可变区,成功克隆入冷诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒。重组菌BL21(pCold I-flic)0.5 mmol/LIPTG过夜诱导,SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。Balb/c小鼠免疫和攻毒试验评价重组H7蛋白的免疫原性。结果显示:H7基因(flic)片段945 bp在pColdⅠ中成功表达,大小为31 000,能够与天然EHEC O157∶H7全抗血清反应;免疫小鼠存活率可以达到80%,而非免疫小鼠存活率仅为20%;免疫组粪便排菌数量显著低于对照组(P<0.05)。以上结果说明,H7鞭毛的可变区与菌体黏附密切相关,并且其诱导产生的抗体具有一定的抑制黏附作用,可以作为亚单位疫苗研制的候选抗原,在EHEC O157∶H7早期黏附时,协同Ⅲ型分泌系统蛋白降低菌体在肠道内的黏附。

用RAPD技术分析出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 应用RAPD技术分析肠出血性大肠杆菌O1 57∶H7DNA多态性并对其分型。方法 用两条1 0bp的随机引物对 3株肠出血性大肠杆菌O1 57∶H7和 3株其它病原性大肠艾希氏菌进行扩增 ,扩增产物经凝胶电泳后得到指纹图。结果 共得到 1 2个不同的DNA指纹图谱 ,经统计软件SPSS系统聚类分析得到两个不同的分类树状图。结论 RAPD技术方法简便、快速、分辨力高 ,在肠出血性大肠杆菌O1

肠出血性大肠杆菌O157∶H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白。融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体。3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3200。Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应。应用3株单抗均可特异性检出EHECO157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应。

亚甲基蓝对肠出血性大肠杆菌O157的光动力杀菌技术研究

研究了亚甲基蓝对革兰氏阴性菌肠出血性大肠杆菌O157的光动力杀伤作用的条件参数。采用单因素实验比较了亚甲基蓝浓度、光照时间、孵育时间对O157菌落数的影响。在此基础上运用Box-Behnken的中心组合实验设计,优化了该技术的条件参数,建立了各因子与O157菌落数关系的数学回归模型,确定了最佳的反应条件,即亚甲基蓝浓度为24.08mg/L,光照时间为27.66min,孵育时间为19.00min时,O157的菌落数对数为1.03,与预测的理论值1.00极为接近。

江苏省肠出血性大肠杆菌O157:H7监测资料分析

目的 :了解江苏省肠出血性大肠杆菌 O15 7:H7在宿主动物与人群中的分布及其毒力基因携带状况 ,调查不同人群中致泻性大肠杆菌的感染率。方法 :用免疫磁珠分离法 (IMS)对江苏省6个监测点的宿主动物和人粪便标本进行 O15 7:H7的分离培养 ,并用多重引物 PCR方法 (MPCR)检测分离菌株的志贺氏样毒素 (SL T1和 SL T2 )、粘附抹平因子 (eae A)及溶血素 (hly) 4种毒力基因。结果 :监测共采集腹泻病人及健康人群粪便标本 130 8份 ,宿主动物粪便标本 130 7份。其中 ,流行前期腹泻病人粪便标本 70 7份中检出肠道致病菌阳性标本 110份 ,阳性率 15 .5 6 %。菌株有 6种肠道致病菌 ,包含 1株 O15 7:H7。流行后期腹泻病人粪便标本 30 2份和健康人群粪便标本 2 99份 ,均未检出肠道致病菌。宿主动物粪便标本 130 7份 ,检出 O15 7:H710株 ,阳性率 0 .76 %。流行后期阳性率2 .2 7% ,非常显著地高于流行前期 (χ2 =16 .94 ,P<0 .0 1)。不同宿主动物中检出存在差异 ,其中牛检出率最高为 1.77%。 11株 O15 7:H7菌株毒力基因测定 ,携带 SL T2 +eae A+hly10株 ,携带 eae A+hly1株。枯水期与丰水期水源水标本 6 9份 ,未检出 O15 7:H7。结论 :江苏省腹泻病人和宿主动物中均能检出肠出血性大肠杆菌 O15 7:H7,且菌株均携带毒力基因。?

肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速可视化检测

目的应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术和羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue,HNB)指示剂建立肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7快速可视化检测方法。方法针对EHEC O157∶H7脂多糖编码基因rfbE保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料HNB作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,并评价检测方法的特异性和灵敏度。结果本方法最低检出限约为100拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅EHEC O157∶H7反应管HNB颜色由紫罗兰变成天蓝色,而肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均不发生变色反应;体系的扩增效率高于普通PCR,40 min内出结果。结论建立的基于颜色判定的EHEC O157∶H7 LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于EHEC O157∶H7现场快速检测。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 TccP基因克隆、表达及其抗原性鉴定

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)基因,并研究其抗原性。方法采用PCR法自EHEC O157∶H7 Sakai菌株基因组扩增TccP基因,构建TccP原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经初步纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗TccP多克隆抗体。抗体效价及特异性用ELISA法和Western blotting法进行测定和分析。结果从EHEC O157∶H7 Sakai菌株中克隆出了1014bp的TccP基因。构建的重组质粒pET28a-TccP在大肠杆菌中获得了高效表达;以TccP免疫家兔获得了高效价多克隆抗体,Western blotting分析此抗体能与TccP发生特异性抗原抗体反应。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了TccP基因,所获TccP具有良好的抗原性,为进一步研究TccP在EHEC O157∶H7致病机制中的作用奠定基础。

肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测方法进展

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7为新近报道的食源性强致病菌,对病原菌快速、简便、准确、灵敏的检测方法是预防控制的关键,本文对国内外常用的鉴别培养、免疫检测以及PCR等检测方法进行了系统的综述。

肠出血性大肠杆菌O157:H7外膜蛋白A敲除菌株的构建及其黏附作用研究

目的利用Red同源重组技术构建肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7外膜蛋白A(ompA)基因敲除菌株,研究敲除菌株的黏附能力变化,阐明OmpA在细菌黏附以及致病中的作用。方法利用Red同源重组技术对EHEC O157∶H7 ompA基因进行敲除,同时构建EHEC O157:H7 ompA回复突变菌株,最后通过细胞试验对EHEC O157∶H7野生型菌株、敲除菌株及回复突变菌株的黏附能力进行比较。结果成功构建了EHEC O157:H7 ompA基因敲除菌株及其回复突变菌株。细胞试验结果表明,与野生型菌株相比,敲除菌株的黏附能力明显下降,而将ompA基因进行回复突变后其黏附能力又得到回复。结论 OmpA在EHEC O157∶H7黏附HeLa细胞过程中发挥重要作用,ompA基因敲除菌株的获得为进一步研究其功能提供了帮助。

肠出血性大肠杆菌O157:H7的分子生物学检测及PCR检测

大肠杆菌一些特殊的血清型具有致病性,肠出血性大肠杆菌是大肠杆菌的一个亚型,主要致病菌株为O157:H7,可引起感染性腹泻,因能引起人类的出血性肠炎而得名。本文综述了分子生物学检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的研究进展。分子生物学检测是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质的分析方法,主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体免疫金层析法以及免疫磁珠分离法(IMS)。PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7,主要包括常规PCR检测、多重PCR检测以及实时荧光定量PCR检测。这两种方法灵敏度高、特异性强、操作简便、结果准确等优点,是检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的常用方法。