可注射性分化微控单元和细胞单元体内构建大尺寸骨组织的研究

目的:探索一种操作简单、实用性强的体内构建大尺寸骨组织的方法。方法:采用大鼠双侧股骨及胫骨原代培养骨髓间充质干细胞(BMSCs),应用流式细胞仪鉴定BMSCs表面标志物、倒置显微镜观察细胞形态、Von Kossa矿化结节染色观察BMSCs成骨分化、油红O染色观察BMSCs的成脂分化情况。用CBD-BMP2(具有胶原结合区的BMP2)和微米级胶原丝结合构建分化微控单元,用大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)和Cultispher-s胶原微球构建细胞单元。分别用注射器把分化微控单元-细胞单元混合组(实验组)、细胞单元组(对照组1)、分化微控单元组(对照组2)注入到11只SD雄性大鼠背部皮肤下,3组大鼠养至30 d后处死,取出皮下培养出的仿生组织。电镜及显微(Micro)CT扫描观察仿生组织表面和内部结构,对仿生组织进行HE染色、碱性磷酸酶(ALP)染色来观察组织内细胞分布及成骨成分的染色表达。采用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(BCIP)/四唑淡蓝(NBT)ALP显色试剂盒对仿生组织进行碱性磷酸酶活性检测;能谱分析测定仿生组织的钙离子含量;压缩模量检测仿生组织的生物力学强度。结果:P3代BMSCs表面阳性抗原CD44和CD90表达比例分别为95.11%、96.18%;造血表面标志CD11b和CD45的比例分别为1.18%、1.82%。BMSCs呈梭形、融合成片、旋涡状。BMSCs成骨诱导后可见大量的黑色矿化结节形成;BMSCs成脂诱导后可见大量的圆形红色的脂滴形成。实验组培养出大小约为1.3 cm×2.1 cm×0.6 cm、质地较硬的骨样组织,对照组1组培养出大小为1.0 cm×1.0 cm×0.4 cm、质地软的组织,对照组2未培养出成形组织。电镜及Micro-CT可见实验组仿生组织的外表为高信号的骨性结构,内部也充满大范围的高信号的骨性结构;对照组1仿生组织则未发现高信号结构。HE染色显示实验组形成大量骨组织,对照组1则未形成骨组织。实验组较对照组1产生更多的ALP,且实验组ALP活性高于对照组1[(0.023±0.005)nmol·mg ^(-1)·min ^(-1)比(0.005±0.002)nmol·mg ^(-1)·min ^(-1), P<0.05]。实验组钙离子含量为7.42%,对照组1为0.34%。实验组压缩模量高于对照组1[(2.62±1.41)MPa比(0.03±0.01)MPa, P<0.05]。 结论:利用细胞单元和分化调节单元在体内构建出大尺寸骨组织简单可行。细胞单元和分化微控单元具有可注射性,可以直接将其注入到骨折或者骨缺损处进行治疗,为组织工程走进临床试验提供了新思路。