肝癌相关抗原SMP30重组基因的构建、表达及分子伴侣共表达系统的探索

旨在通过应用基因工程的方法构建、表达和纯化肝癌相关抗原SMP30,研究共表达分子伴侣提高基因工程蛋白表达的可溶性及效率。PCR扩增SMP30 cDNA序列,用基因工程技术构建重组表达质粒,转化E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌。表达蛋白经Ni-NTA亲和柱纯化获得HIS-SMP30融合蛋白;分别将4种表达不同分子伴侣的质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16)转入E.coliBL21(DE3)中;然后再将重组质粒转入含有分子伴侣质粒的细胞中,进行分子伴侣与重组质粒的共表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量与可溶性分析。经优化表达条件后,目的蛋白以包涵体形式表达,目的蛋白占总蛋白的60%以上;纯化后纯度高达95%以上;诱导共表达后,目的蛋白在上清含量极少,不到总表达目的蛋白的10%。成功构建出高效表达的SMP30重组质粒;加入到诱导表达体系中的4种分子伴侣质粒不能有效的促进可溶性蛋白的表达,pTf16共表达系统能增加目的蛋白表达量。

携带BCoV抗原表位的乙型肝炎病毒核心抗原病毒样颗粒的制备及免疫效果评价

为了制备可用于牛冠状病毒(BCoV)亚单位疫苗的含BCoV S蛋白抗原表位的病毒样颗粒(VLP),本研究将BCoV S1和S2蛋白中含B细胞表位的aa351~aa403(159 bp)和aa771~aa784(42 bp)对应的密码子按大肠杆菌偏好性原则优化后插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)主要免疫显性区域(MIR),合成该重组基因后克隆至pET-32a(+),经酶切鉴定显示正确构建了重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-BCoV S1+S2。将该重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)和伴侣感受态细胞BL21(DE3)(含pG-KJE8分子伴侣质粒),经诱导表达后采用镍柱亲和层析法纯化两种不同表达形式的重组蛋白,SDS-PAGE检测重组蛋白的表达及纯化效果,结果显示两种表达系统均正确表达了重组蛋白,分别命名为VLP-A、VLP-B,前者为包涵体表达,后者为可溶性表达。纯化后浓度分别为0.9 mg/mL、1.4 mg/mL。利用透射电镜观察纯化后的两种重组蛋白是否形成VLP,结果显示二者均形成VLP,且可溶性表达的重组蛋白形成的VLP产量略高。将两种VLP乳化后以50μg/只分别免疫小鼠,于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d采血制备血清,采用ELISA方法检测小鼠血清中的BCoV IgG特异性抗体水平及细胞因子IFN-γ、IL-4,结果显示,将两种VLP乳化后免疫小鼠产生的BCoV IgG抗体(P<0.01)和两种细胞因子水平(P<0.05)均显著高于对照组,且可溶性表达的VLP诱导产生的抗体水平和细胞因子水平更高。本研究首次制备了含BCoV S蛋白抗原表位的VLP,两种不同表达形式的重组蛋白均形成VLP,且在小鼠体内均能够产生免疫应答,为BCoV亚单位疫苗及相关生物制品的制备奠定了基础。