改良分子信标-实时PCR快速检测副溶血弧菌

目的 :建立改良分子信标 -实时 PCR检测副溶血弧菌的快速方法 ,应用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法 :根据 Gen Bank公布副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因 (TDH)的保守序列 ,设计一对引物和改良分子信标探针 ,用 FAM荧光剂标记探针的 5′,并进行特异性和灵敏度分析 ;同时以 11种细菌作对照 ,建立改良分子信标检测副溶血弧菌的实时 PCR反应体系 ,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果 :检测 12种细菌 ,只有副溶血弧菌有荧光信号 ,与其他细菌无交叉反应 ,DNA灵敏度为 16 6 .6 fg/ μl,菌液灵敏度为 6 9cfu/ ml或 6 cfu/ PCR反应体系。改良分子信标 -实时 PCR反应体系检测 4 0株副溶血弧菌均出现特异的荧光信号 ,无干扰。对 3起细菌性食物中毒共 4 8份样品和 10 0份海产品进行检测 ,9份副溶血弧菌实时 PCR阳性 ,其中 7份副溶血弧菌细菌培养阳性 ,其余样品都为阴性。检测时间仅需 2 h。结论 :改良分子信标 -实时 PCR检测体系快速、灵敏度高 ,特异性强 ,可用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断 。

改良分子信标-实时PCR快速检测志贺菌

目的:建立改良分子信标-实时PCR检测志贺菌的快速方法,应用于志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。方法:根据GenBank公布志贺菌ipaH基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR-改良分子信标检测体系,应用于对志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为93 fgμ/l,菌液灵敏度为64 cfu/m l或2 cfu/PCR反应体系,无交叉反应。此反应体系检测67株志贺菌,均出现特异的荧光信号。对细菌性食物中毒样本等共657份样品进行志贺菌检测,42份志贺菌实时PCR阳性,其中41份志贺菌细菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需2 h^1 d时间。结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于志贺菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段,对于提高肠道门诊的工作效率有重要意义。

分子信标-实时PCR法快速检测双歧杆菌的研究

为建立双歧制品中双歧杆菌快速、敏感、特异的检测方法,根据双歧杆菌16SrRNA/16SrDNA基因设计合成了双歧杆菌属特异性引物和分子信标探针,建立了快速检测双歧杆菌的分子信标-实时PCR检测方法,并对反应条件进行优化。检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%;特异性强,扩增曲线呈现明显的S型,无非特异性扩增;灵敏度高,是普通PCR的100倍,对纯双歧杆菌DNA的检出限为5.7fg/PCR反应体系,纯双歧杆菌菌液的检出限为2×103CFU/mL;线形范围宽,起始模板数在2×108CFU/mL～2×104CFU/mL之间具有良好的线性关系,相关系数大于97%。该方法具有灵敏、特异、简便和快速的特点,可用于对双歧杆菌原位菌数的定量检测。

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的:建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌(LMO)的快速方法,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法:根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标-实时PCR检测体系,应用于食品中LMO检测。结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110 fg,菌液灵敏度为99 cfu/m l或4 cfu/PCR反应体系,无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时间由原来的至少4 d缩短至1 d。对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性,其中6份LMO细菌培养阳性。结论:改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,能提高LMO的检出率和准确性,可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断。

改良分子信标-双重实时荧光PCR快速检测SARS病毒

目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒的方法,用于SARS的早期诊断和动物溯源。方法利用改良分子信标技术、装甲RNA和双片段双色荧光技术,根据GenBank公布的SARS病毒聚合酶基因1b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,以部分临床标本的酶联吸附实验结果和传统细胞培养方法作为对照,建立分子信标检测SARS病毒的方法。对368份临床标本(咽漱液、血液、粪便、尿液)、52份细胞培养液和50份动物标本进行荧光PCR扩增。结果分子信标检测SARS病毒的方法灵敏度为10～100个拷贝ml,与流感病毒等呼吸道病毒无交叉反应。分子信标检测368份临床标本,20份阳性。其中确诊病例阳性率为21.27%(1047),确诊病例的咽漱液阳性率为43.48%,还分别从粪便和血清中检测到SARS病毒。52份细胞培养液,29份阳性,阳性率为55.77%。50份动物标本,23份阳性,阳性率为46%。结论改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源。

改良分子信标—实时PCR快速检测霍乱弧菌

目的 建立改良分子信标—实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法 ,应用于霍乱监测。 方法 根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位 (ctxA)的保守序列 ,设计一对引物和改良分子信标探针 ,并进行特异性和灵敏度分析 ;同时以 11种细菌作对照 ,建立改良分子信标检测霍乱弧菌的实时PCR反应体系 ,应用于霍乱监测。 结果 霍乱弧菌改良分子信标检测体系检测 12种细菌 ,只有霍乱弧菌有荧光信号 ,与其他细菌无交叉反应 ,DNA灵敏度为10 2 4fg/ul ,菌液灵敏度为 3 2cfu/ml或 3cfu/PCR反应体系。对 10 0份海产品和 3 0份腹泻病人大便标本进行检测 ,结果都为阴性。检测时间仅需 2h。 结论 改良分子信标—实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强 ,可用于霍乱的快速诊断 。

阪崎肠杆菌zpx基因的分子信标-实时PCR技术研究

目的建立分子信标-实时PCR技术检测婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速方法。方法在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5'端标记FAM,3'端标记TAMRA,建立阪崎肠杆菌zpx基因分子信标-实时PCR技术快速检测方法。结果检测方法特异性强,无非特异性扩增;分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为180fg/PCR反应体系,纯阪崎肠杆菌菌液的检出限为102 CFU/ml,无交叉反应;以此反应体系检测23份样品,其中2份为阳性,余未检出,与传统检测方法结果一致。结论分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测。

分子信标-实时PCR法快速检测阪崎肠杆菌的研究

目的:建立分子信标-实时PCR检测婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速方法。方法:根据GenBank公布的阪崎肠杆菌ATCC29544株ompA基因的保守序列,设计引物和分子信标探针,建立阪崎肠杆菌的分子信标-实时PCR技术快速检测,应用于食品检测。结果:检测方法特异性强,无非特异性扩增;分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为95fg/PCR反应体系,无交叉反应;以此反应体系检测23份样品,其中3份为阳性,余未检出,与传统检测方法结果一致。结论:分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测。

改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O_(157):H_7

目的建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157H7的快速方法。方法根据GenBank公布O157H7的rfbE保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5’端,建立改良分子信标实时PCR检测O157H7的反应体系,应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果共检测11种细菌,只有大肠杆菌O157H7有荧光信号,其余10种全无荧光信号,且与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为64fg,菌液灵敏度为59cfu/ml或2cfu/PCR反应体系。应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O157H7均出现特异的荧光信号,无干扰。对89份食品样品进行检测,5份O157H7实时PCR阳性,其余样品为阴性,检测仅需2h。5份阳性样本,经传统方法培养,有3份检出大肠杆菌O157H7。结论改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于大肠杆菌O157H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。

分子信标实时荧光PCR检测登革病毒方法初步建立

目的建立登革病毒分子信标实时荧光PCR检测方法。方法针对登革病毒3’-UTR保守区设计引物和分子信标探针,构建阳性参考质粒,建立登革病毒分子信标实时荧光PCR检测方法。应用建立方法对血清标本进行检测,检测结果与Taq Man探针法进行比较。结果所建立的分子信标荧光PCR检测方法灵敏度达102copies/μL,与其它病毒无交叉反应;对70份血清标本检测结果与Taq Man探针法一致。结论所建立的分子信标荧光探针法具有较高的灵敏度和特异度。

分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因

目的用分子信标探针PCR快速检测志贺菌属(Shigella)。方法根据GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列,设计引物和分子信标探针,以4种细菌进行对照,进行特异性和灵敏度分析,建立Shigella的实时PCR技术快速检测,应用于食物中毒和食品检测。结果检测20个样本,Shigella呈阳性,其它呈阴性,时间约2h。结论Shigella分子信标探针技术具有快速、灵敏度高、特异性强等特点,可用于Shigella食物中毒快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。

副溶血性弧菌tdh基因的分子信标PCR技术检测

目的采用分子信标PCR技术进行副溶血性弧菌tdh基因检测。方法在反应体系中加入分子信标探针。对13株副溶血性弧菌和其他细菌分别进行tdh基因实时和终点法荧光检测。结果2株副溶血性弧菌和阳性质粒的终点法检测荧光值分别为114．9，95．2，90．0。实时PCR检测的CT值分别为26．2，26．8，32．0。其他肠道细菌终点法检测荧光值为47．0～69．1；CT值〉32．0或无值，与琼脂糖电泳分析结果一致。结论分子信标PCR技术可以准确、快速、实时、简便地进行副溶血性弧菌tdh基因检测。

分子信标探针技术用于PCR检测诺卡氏菌SecA1基因

目的将诺卡氏菌属细菌的一段特异性DNA设计成分子信标探针,用于该细菌的PCR检测。方法将诺卡氏菌属细菌、戈登氏菌属细菌及红球菌属细菌菌株分别接种于脑心浸液琼脂培养基分离培养,观察其生长情况,提取菌株DNA作为扩增模板;设计诺卡氏菌属细菌基于secA1基因的特异性分子信标探针,在实时荧光定量PCR反应译体系中加入分子信标探针,PCR产物进行荧光信号检测。结果诺卡氏菌secA1基因经实时荧光定量PCR扩增后可产生阳性荧光信号,红球菌属细菌及戈登氏菌属细菌的secA1基因、阴性对照实验组及空白对照组经实时荧光定量PCR扩增后不产生荧光信号,为阴性。结论 secA1作为看家基因,是用来进行种水平的鉴定及系统进化研究非常理想的靶分子,而分子信标探针技术可以准确、快速、灵敏的进行诺卡氏菌secA1基因检测。

分子信标荧光定量PCR检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

利用新型荧光探针—分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和NA基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用实时荧光定量PCR技术检测H3N2亚型SIV。构建重组质粒p SK-H3和p SK-N2并绘制标准曲线。结果显示,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验的重复性变异系数(CV)均小于3%,表明该方法灵敏度强、特异性好。此方法的建立将为流感病毒H3N2亚型定型检测提供一种快速有效的方法。

数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

试验旨在利用新型荧光探针——分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的H3和N2基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型SIV。结果显示,该数字RT-PCR检测方法与其他主要相关病毒均不发生交叉反应,重复性良好;对猪H3N2流感病毒而言,最低可检测到106倍稀释的病毒株。数字RT-PCR方法能够对RNA模板定量分析。在H3N2SIV的鉴定上,数字RT-PCR方法较实时荧光定量PCR方法更灵敏、准确。

荧光分子信标探针检测双歧杆菌的研究

根据双歧杆菌高度保守的寡核苷酸序列,构建一枚荧光分子信标探针,并对探针的性能进行测定分析,利用实时PCR技术对双歧杆菌进行检测。研究结果表明,所构建的分子信标设计合理,合成正确,性能稳定,S/N>20,其发卡既可以闭合也可以打开,符合实时PCR过程对分子信标的要求;该信标探针对双歧杆菌具有很好的稳定性及特异性,通过实时PCR扩增能有效地将双歧杆菌和非双歧杆菌区别开。因此,荧光分子信标探针可用于对双歧杆菌的检测。

实时荧光定量PCR应用技术综述

实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)于1992年由Higuchi等人第一次报告:使用EB加入PCR反应体系,经改装的带有CCD的PCR仪检测样品的荧光强度,它的优势性决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。随着分子生物学技术的不断发展,rt-PCR技术取得了突飞猛进的发展,也由此诞生了许多与此技术相关的新的分支学科,极大的推动了分子生物学的发展。

改良分子信标-实时荧光PCR同时检测猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌

目的建立猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,应用于食品和食物中毒病人标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断。方法根据GenBank公布的猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的保守序列(CP000857.1),设计引物和改良分子信标探针,优化PCR程序和PCR成分,以11种细菌为对照,建立实时荧光PCR检测方法,并用71株常见血清型的沙门菌评价该方法的灵敏度和特异性,所建立的方法应用于70份食品样品的检测。结果该改良分子信标—荧光PCR方法的DNA最低检出限为10fg/反应体系,菌液最低检出限为20 CFU/反应体系;无交叉荧光信号产生。针对目标菌均出现特异荧光信号。对71株沙门菌属的检测,该方法的灵敏度和特异度为100%。70份食品样品用荧光PCR和传统方法检测猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌,结果均为阴性。该方法从菌株的核酸提取到检测仅需1.5小时,从样品处理到检测仅需1天时间。结论建立的实时PCR检测方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于食品及食物中毒标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断,保障食品安全。

人源细胞间黏附分子-1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

目的建立并验证细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测不同细胞中ICAM-1的基因水平。方法根据GenBank中登录的ICAM-1基因序列设计并合成引物,建立ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法,验证方法的适用性、线性范围、灵敏性、特异性及精密性。同时采用该方法对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、人星形神经胶质瘤细胞(u251)、人原发性肝癌细胞(PLC/PRF/5)、人胚肾细胞(HEK293)及人脐静脉内皮细胞(HuvEc)进行检测。结果该方法的溶解曲线峰单一,无非特异性产物和引物二聚体;标准质粒在6.74×104~6.74×109 copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好的线性关系,线性方程为y=-3.576 log x+42.982,R2=1.000;建立方法的灵敏性是普通PCR法的10倍;该方法检测不同物种细胞无交叉反应,仅能检出人源细胞ICAM-1;批内和批间CV均<1%。不同组织来源的细胞内ICAM-1基因含量不同,其中MRC-5细胞含量最高。结论成功建立了ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,且具有良好的特异性、灵敏性及精密性,可用于ICAM-1基因的定量检测。