输注分子嵌合前体T细胞减低小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠T细胞的刺激反应

目的构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠前体T细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞减低对异基因小鼠T细胞反应的可行性。方法体外分离培养BALB/c小鼠前体T细胞,构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因(H-2Db和H-2Kb)真核表达载体pIRES-H-2Db和pIRES-H-2Kb,分别转染BALB/c小鼠前体T细胞,构建分子嵌合前体T细胞。将分子嵌合前体T细胞回输BALB/c小鼠后7天,获取脾脏T淋巴细胞,与C57BL/6小鼠T细胞进行混合淋巴细胞培养,观测刺激指数(SI)。结果成功体外培养BALB/c小鼠前体T细胞,体外转染C57BL/6小鼠H-2Db和H-2Kb基因至BALB/c小鼠前体T细胞,H-2Db和H-2Kb蛋白表达率分别可达(14.90±0.56)%和(14.20±0.63)%。单向混合淋巴细胞培养显示,输注分子嵌合前体T细胞的BALB/c小鼠脾脏T细胞对C57BL/6小鼠T细胞SI,在pIRES-H-2Db和pIRES-H-2Kb转染的小鼠前体T细胞共注射组为(0.764±0.074),比空质粒组(0.983±0.081)和未转染组(0.994±0.142)明显下降(均P<0.05)。共注射组SI值分别与转染质粒pIRES-H-2Db组SI值(0.859±0.085)和转染质粒pIRES-H-2Kb组SI值(0.860±0.097)相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因前体T细胞的小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠T细胞刺激反应明显减低。

^99mTc标记的抗CEA小分子嵌合抗体的体内分布与肿瘤显像

[目的]采用99mTc标记抗人CEA小分子嵌合抗体Rch24 F(ab’)2,研究其在荷人结肠癌裸鼠体内的生物学分布及放射免疫显像的特征与应用价值。[方法]采用SnCl2直接还原法标记抗体,快速薄层层析法(ITLC)测定抗体的标记效率、放化纯度和体外稳定性,ELISA检测标记抗体的免疫比活性。荷人结肠癌裸鼠尾静脉注射99mTc-Rch24 F(ab’)2后,研究标记抗体在裸鼠体内的生物学分布,并进行肿瘤显像。[结果]99mTc-Rch24 F(ab’)2的标记率为90%,放化纯度>95%。99mTc-Rch24 F(ab’)2的放射比活为840MBq/mg,免疫比活性为65.7%。标记抗体24h时放射性脱落小于5%。荷瘤裸鼠注射99mTc-Rch24 F(ab’)23h后即可观察到肿瘤影像,5~24h均可获得清晰的肿瘤影像,标记抗体在体内呈肿瘤靶向性分布,12h时肿瘤的摄取和多数脏器T/NT比值均达到最高水平。[结论]99mTc-Rch24 F(ab’)2在体内靶向分布于结肠癌肿瘤组织,具有较高的T/NT比值并可在肿瘤局部滞留,注射99mTc-Rch24 F(ab’)25h后肿瘤成像满意。99mTc-Rch24 F(ab’)2在临床肿瘤的放射免疫分子显像诊断中具有良好的应用前景。

输注分子嵌合小鼠前体T细胞抑制异源小鼠T细胞增殖反应的研究

目的 研究分子嵌合前体T细胞（pre-T细胞）对异基因T淋巴细胞增殖能力的影响,旨在为研究同种异体器官移植诱导免疫耐受提供新策略.方法 RT-PCR获取C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ等位基因H-2Kb和H-2Db基因,并与pIRES质粒连接,构建重组质粒并转染体外培养BALB/c小鼠pre-T细胞构建分子嵌合细胞,并设立未转染及转染空质粒对照组.各组细胞回输BALB/c小鼠,7d后提取各组小鼠脾脏T细胞,将其与C57BL/6小鼠T淋巴细胞混合培养,观察刺激指数（SI）.结果 构建质粒测序表明,插入序列的结果包含GenBank检索的C57BL/6小鼠H-2Kb和H-2Db序列,流式细胞仪检测质粒pIRES-H-2Kb和pIRES-H-2Db转染后,pre-T细胞表面H-2Kb及H-2Db蛋白的表达增高,与未转染组及转染空质粒组相比,其差异均具有统计学意义（P＜0.05）.单向混合淋巴细胞培养结果显示：2质粒共注射pre-T细胞组的SI值（0.764±0.074）较空质粒组（0.983±0.081）和未转染组（0.994±0.142）明显下降,其差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 分子嵌合细胞可降低受体T细胞对异基因T淋巴细胞刺激的增殖反应,有望应用于体内诱导免疫耐受.

GPI锚固型CD46/CD55嵌合分子的设计及构建

目的 选取调控补体活化中心环节C3转化酶的两种膜调节蛋白CD4 6和CD5 5 ,设计构建了新型的GPI锚固型CD4 6 /CD5 5嵌合分子。方法 以CD4 6cDNA和CD5 5cDNA为模板 ,通过PCR及PCR重叠延伸技术 (SOE)得到CD4 6 /CD5 5嵌合cDNA。为避免双分子连接后的空间结构和功能的变化 ,在CD4 6与CD5 5之间引入了多肽氨基酸接头 (Linker) ,然后克隆构建GPI锚固型CD4 6 /CD5 5 BluescriptM13克隆载体。结果 获得了阅读框完整、连接部位正确的GPI锚固型CD4 6 /CD5 5嵌合分子cDNA。结论 本研究为研制开发新一代的多功能。

嵌合分子VEGI^+的构建、表达及其抗血管生成和抗肿瘤活性

血管内皮细胞生长抑制因子VEGI是肿瘤坏死因子超家族新成员 ,通过诱导内皮细胞凋亡而抑制肿瘤生长。通过PCR方法将CTTHWGFTLC与VEGI2 3- 1 74氨基酸相连 ,构成嵌合分子VEGI+。原核表达的VEGI+经过纯化后 ,以非重折叠的沉淀形式进行活性实验 ,VEGI+能够抑制鸡胚尿囊膜血管新生 ,对于Lewis肺癌小鼠移植瘤 ,5mg L组抑瘤率 99.7% ,1 0mg L组抑瘤率96% ,2 5mg L组抑瘤率 83%。实验说明VEGI+通过抑制血管新生对移植瘤的早期发展起抑制作用。

RNA/DNA嵌合分子介导的高效基因修复

本文介绍了RNA/DNA嵌合分子介导的高效基因修复技术。这一技术是1996年开始发展起来的全新技术 ,它通过人工合成的双链开环RNA/DNA嵌合分子转染细胞而使特定基因靶位点产生单碱基改变 ,从而修复突变基因。这一技术高效 (目前最高可达50 %以上 )、特异性强、安全、无随机插入致变的危险、无免疫反应、无明显毒性 ,能够用于定点突变、基因敲除、动植物功能基因组学、药物遗传学等很多方面的研究 ,在不久的将来能够应用于人类基因治疗 ,具有很高的应用价值和医学前景。

PRGDWR-尿激酶原双功能嵌合分子的性质研究

为赋予单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (singlechainurokinase typeplasminogenactivator,scu PA ,尿激酶原 )以抗血小板聚集的功能 ,在scu PA的kringle区 118位Gly与 119位Leu之间插入PRGDWR序列 (insertmutantB ,InB) .利用甲醇酵母 (Pichiapastoris)进行分泌表达 ,经金属离子螯合亲和层析与S强阳离子交换层析 ,得到纯蛋白 .实验测定InB对人工合成底物S 2 44 4的酰胺解活性为 5 90 0IU/mg ,动力学常数为 :KInBm ,S 2 4 44 =5 6 8μmol·L-1,kInBcat,S 2 4 44 =0 33s-1;水解天然底物 plasminogen的动力学常数为 :KInBm ,plg=0 397μmol·L-1,kInBcat,plg=0 0 16 4s-1.InB激活 plasminogen的反应在有fibrin存在条件下InB的活性为无fibrin条件下的 46 3% .该突变体在体外激活 plasminogen的活性与同一系统表达的野生型scu PA基本相同 .该突变体表现出较强的抗血小板聚集活性 ,IC50 =12 7μmol·L-1,而野生型scu PA无此功能 .实验表明scu PA的K区插入突变体InB是一种极具潜力的双功能溶栓分子 .

RGD多肽与尿激酶原嵌合分子的构建及性质研究

利用定点突变及DNA重组技术 ,将编码RGD多肽 (GPRGDWRMLG)的双链DNA片段 ,定向插入到相对于编码尿激酶原的Gly118 Leu119的cDNA分子中 ,构建了尿激酶原的嵌合体基因 ,并在甲醇酵母表达系统中进行了分泌表达。经过Zn2 + 螯合柱及SP阳离子柱两步层析后 ,目的蛋白质被纯化。经纤维蛋白平板测活 ,嵌合分子的比活为 6 5 0 0 0IU mg。嵌合分子与尿激酶相比 ,对显色底物S2 44 4作用的催化效率偏低 ,但具有较强的抑制血小板聚集的功能 ,抑制常数IC5 0为 2 1μmol L。以上结果表明嵌合分子不但具有较强的溶栓功能 ,而且具有抗栓功能 ,很可能是一种具有发展前景的双功能溶栓

嵌合抗CD_(20)抗体分子在CHO细胞中的表达

利用PCR方法从抗CD2 0 抗体Fab′片段的表达载体上扩增抗CD2 0 抗体的轻链和重链可变区 ,将轻链和重链可变区组装到含有人抗体恒定区的表达载体中 ,构建抗CD2 0抗体IgG的轻链和重链表达载体PK10 0VL和PGL0 5VH ,并用质脂体法共转染CHO细胞 ,RT PCR和ELISA检测结果证实了抗CD2 0 抗体IgG全分子在CHO细胞中的分泌表达。免疫结合结果表明CHO细胞分泌表达的抗CD2 0 抗体IgG全分子可与CD2 0 阳性的B淋巴瘤Raji细胞结合。

组织型纤溶酶原激活剂A链与尿激酶原B链嵌合分子的构建与表达

利用 Ｄ Ｎ Ａ 重组技术和定位删除技术，将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ Ｐ Ａ）的 Ａ 链（ Ｓｅｒｌ Ｔｈｒ２６３）基因与尿激酶原（ｐｒｏ Ｕ Ｋ）的 Ｂ链（ Ｓｅｒ１３８ Ｌｅｕ４１１）基因相连，得到嵌合分子基因ｔｕｐａ，并在昆虫杆状病毒系统中进行表达，表达量可达 ５００ Ｉ Ｕ／ｍ ｌ．经单克隆抗体免疫亲和层析纯化细胞表达上清液，得到ｔｕ Ｐ Ａ 嵌合分子，其比活为 ２００ ０００ Ｉ Ｕ／ｍ ｇ 蛋白． Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 及 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定证明此表达产物分子量约为 ６０ ｋ Ｄ，与预期值相符．纤维蛋白平板测活及纤维蛋白亲和性分析初步证明，此嵌合分子的溶纤活性与ｐｒｏ Ｕ Ｋ 相近，而纤维蛋白亲和性高于 ｐｒｏ Ｕ Ｋ．

可溶性嵌合补体抑制分子的构建及表达

目的 制备能抑制补体活化的 2个关键环节 (C3 C5转化酶和MAC的形成 )的一种新型、高效补体抑制剂。方法 先设计引物 ,然后通过PCR技术扩增重组可溶性CD46 CD55 CD59嵌合分子cDNA片段 ,重组于pSecTagA真核表达载体上 ,分别利用COS 7细胞和中国仓鼠卵巢 (Chinesehamsterovary ,CHO )细胞进行表达 ,并用抗人CD46多克隆抗体及抗人CD55、CD59单克隆抗体对表达产物进行westernblotting鉴定。结果 DNA测序证实 ,前端带有小鼠IgGκ链前导序列 ,后端融合有编码 6个组氨酸碱基的CD46 CD55 CD59嵌合分子cDNA片段的阅读框完整。免疫印迹结果显示 ,表达的重组蛋白分别能与抗人CD46多克隆抗体和抗人CD55、CD59单克隆抗体结合。结论 成功构建并在真核细胞内表达了重组可溶性CD46 CD55 CD59嵌合分子 ,为进一步研制和开发新一代多功能、多靶点补体抑制剂奠定了基础。

嵌合分子ut-PA(1)sf-9表达产物的纯化及其性质的初步鉴定

嵌合蛋白 ut- PA( u- PA与 t- PA的嵌合型纤溶酶原激活剂 )基因删除编码 u- PA中 R1 78—R1 81的 1 2个核苷酸后 ,得到的嵌合分子 ut- PA( 1 )在昆虫细胞 sf- 9中表达 ,通过苯甲脒 -Sepharose 6B亲和柱层析对表达产物进行纯化 .得到的纯品走 SDS- PAGE,结果显示 ,其分子量为60 k D.血凝块溶解实验结果表明 ,嵌合分子 ut- PA( 1 )有良好的体外溶栓能力 .在不同剂量 PAI- 1的抑制条件下测定 ,亲本嵌合蛋白 ut- PA的活力分别下降 2 2 .7%和 1 3.8%时 ,嵌合分子 ut- PA( 1 )只分别下降了 1 2 .9%和 9.1 % .说明突变体 ut- PA( 1 )具有一定的对 PAI-

抗人活化血小板单抗的Fab片段与尿激酶B链的嵌合分子制备及其体外溶栓研究

抗体介导的纤溶剂是以抗体与血栓呈高选择的结合为基础的。本研究利用自制的抗人活化血小板α-颗粒膜蛋白(GMP—140)的单抗SZ—51,经木瓜蛋白酶消化制备抗体的Fab片段,与纤溶剂尿激酶的B链经化学双功能交联剂SPDP交联后,其嵌合分子的体外溶栓率较尿激酶高3～5倍,而血浆中纤维蛋白原及纤溶酶原的消耗减少,提示溶栓率的提高与嵌合分子的选择性增高有关,这种新型的嵌合分子将为体内特异性溶栓剂的研制提供一条新的途径。

嵌合DNA hsp70/CD80真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建hsp70 /CD80嵌合DNA真核表达质粒 ,并对其进行鉴定。方法 采用基因工程技术 ,分别以pBR32 2-hsp70和 pcDNA3-CD80质粒为模板 ,经聚合酶链反应 (PCR)扩增出hsp70 /CD80嵌合目的基因 ,然后与 pcDNA3载体进行连接重组 ,构建成hsp70 /CD80嵌合DNA真核表达质粒 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定。结果 hsp70 /CD80嵌合DNA重组真核表达质粒经证实构建成功。 结论 hsp70 /CD80嵌合DNA重组真核表达质粒的成功构建 ,为进一步制备结核病hsp70 /CD80嵌合DNA疫苗奠定了基础。

嵌合跨膜型人CD55基因的重组逆病毒表达质粒的构建

目的 构建嵌合跨膜型CD5 5基因的重组逆病毒表达质粒。方法 采用PCR技术扩增编码CD5 5信号肽及成熟蛋白胞外区 (-3 4 -3 0 4aa)的DNA片段 ,双侧引入EcoRⅠ、SspⅠ位点 ,与编码CD46分子的跨膜区及膜内区 (2 70～ 3 5 0aa)的DNA片段的5’末端自身的StuI位点连接 ,构建嵌合跨膜型CD5 5DNA片段 ,序列测定后将此嵌合CD5 5片段与pLXSN逆病毒载体连接构建重组表达质粒 ,酶切鉴定插入片段的方向。结果 DNA序列测定证实所构建的嵌合跨膜型CD5DNA阅读框完整、连接部位序列正确 ;HindⅢ酶切鉴定得到了正向插入的CD5 5TM pLXSN重组表达质粒。结论 我们成功构建了嵌合跨膜型CD5 5DNA片段及含此片段的重组逆病毒表达载体CD5 5TM pLXSN ,为进一步在真核细胞中表达嵌合分子 ,比较研究GPI锚固型CD5 5分子与细胞活化信号转导的关系建立良好对照并为应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了分子生物学基础。

诱导蛋白降解的小分子PROTACS的研究进展

靶向蛋白降解嵌合分子(PROTACs)是一类能够通过诱导靶蛋白的多聚泛素化而导致靶蛋白降解的小分子化合物,本文对采用不同E3泛素连接酶设计的PROTACs进行了介绍。

嵌合分子靶向降解鼻咽癌细胞表皮生长因子受体的实验研究

目的:检测合成的蛋白靶向嵌合分子(EGF-PROTAC)通过泛素-蛋白酶体途径体外对人鼻咽癌CNE-2细胞表皮生长因子受体(EGFR)靶向降解作用,并证实对该细胞增殖、凋亡的影响。方法:EGF-PROTAC处理细胞后,应用Western blot技术分析EGFR蛋白表达水平;CKK-8、流式细胞术、Transwell侵袭实验检测EGF-PROTAC对CNE-2产生的生物学效应。结果:Western blot技术显示EGF-PROTAC组EGFR蛋白的表达水平显著低于对照组(P<0.05);CKK-8法显示EGF-PROTAC组3、6、9、12hCNE-2细胞存活率显著低于溶剂对照组(P<0.05);流式细胞术显示EGF-PROTAC组细胞凋亡指数显著高于对照组(P<0.05);Transwell法显示EGF-PROTAC组CNE-2细胞侵袭到Transwell小室滤膜下细胞数显著低于溶剂对照组(P<0.05)。结论:EGF-PROTAC能够靶向降解CNE-2细胞的EGFR,在体外能抑制鼻咽癌细胞的生长、促进凋亡。

雄激素非依赖性前列腺癌细胞雄激素受体靶向降解的实验研究

目的:研究合成的嵌合分子DHT-PROTAC通过泛素蛋白酶体途径对雄激素非依赖性前列腺癌C4-2B细胞表达雄激素受体(AR)的靶向降解作用,以及AR降解后该细胞分泌、增殖和凋亡的变化。方法:实验细胞分3组:空白对照组(RPMI1640培养液)、溶剂对照组[0.1%二甲基亚砜(DMSO)]及实验组(100μmol/LDHT-PRO-TAC);制备细胞爬片,免疫组化和Western印迹检测C4-2B细胞中AR蛋白和Caspase-3表达情况的改变;ELISA法测定细胞培养液上清中PSA的浓度改变。噻唑兰(MTT)比色法检测细胞增殖抑制,细胞计数并绘制生长曲线观察细胞增殖能力。结果:与空白对照组和溶剂对照组相比,DHT-PROTAC处理后,C4-2B细胞中表达的AR蛋白明显减少,Western印迹检测结果表现为信号减弱(P<0.05);免疫组化见AR阳性细胞明显减少,阳性率降低达40%;与空白对照组和溶剂对照组相比,DHT-PROTAC处理后细胞培养上清液中PSA浓度降低约60%(P<0.05)。MTT试验显示随着DHT-PROTAC处理时间延长,对C4-2B细胞的抑制率逐渐增大,细胞生长呈时间依赖性抑制(P<0.05)。结论:嵌合分子DHT-PROTAC能靶向降解C4-2B细胞表达的AR,抑制细胞分泌PSA,并抑制该细胞的体外生长和增殖。