注射用丹参分子排阻色谱及指纹图谱差减分析

目的探讨注射用丹参质量差异的分析方法。方法取临床不良反应有差异的不同批号的样品进行平行比对试验,分别应用凝胶分子排阻色谱、碳十八反相液相色谱进行指纹图谱分析,通过综合差减分析揭示非小分子酚酸类成分信息。结果注射用丹参的凝胶分子排阻色谱有显著的批间差异,非小分子酚酸类成分批间差异显著,与豚鼠急性毒性反应程度相对应。结论非小分子酚酸类成分应作为丹参系列注射剂质量控制的重点。提出谱毒学研究是中药注射剂安全性研究的重要方向之一。

强阴离子交换色谱结合分子排阻色谱纯化血清中免疫球蛋白和白蛋白

动物血清中免疫球蛋白和白蛋白的等电点分别约为7.8和4.8,根据它们等电点的较大差别,利用Q Sepha-roseTM-XL强阴离子交换色谱结合分子排阻色谱同时分离纯化这2种蛋白。以0.02mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡离子交换色谱柱并将已稀释10倍的高免疫的兔血清上样,采用pH分段洗脱。在pH 6.0时以0.3mL/min低流速洗脱得到高纯度的免疫球蛋白,继续在pH 4.0时洗脱,再辅以Sephadex G-75分子排阻色谱可获得纯度大于95%的白蛋白。对纯化后的蛋白进行活性检测,证明所纯化的免疫球蛋白和白蛋白都保持正常的生物活性。蛋白质含量测定说明免疫球蛋白的纯化回收率达到95%以上,而白蛋白的纯化回收率大于90%。该法简便快速,可同时从动物血清中纯化出保持生物活性的免疫球蛋白和白蛋白,纯化效率高。

分子排阻色谱纯化核桃蛋白源ACE抑制肽条件优化

为了得到新的ACE抑制肽,采用分子排阻色谱对核桃蛋白碱性蛋白酶水解物进行分离、纯化。优化了分子排阻色谱分离、纯化核桃蛋白水解物的洗脱剂、洗脱流速、上样体积和样品浓度,比较了其纯化前后ACE抑制活性变化、分析了不同组分RP–HPLC图谱及其氨基酸组成。结果表明,以Sephadex G–15为分离介质的色谱优化条件为:超纯水为洗脱剂、洗脱流速0.4 m L/min、上样体积1.5 m L、样品浓度150 mg/m L。在此条件下,经过分子排阻色谱纯化后,得到4个主要组分,其中活性最高组分的ACE抑制率达90.35±0.25%,其IC50值为0.158 mg/m L。经过RP–HPLC进一步分离,分子排阻色谱纯化后高活性组分保留时间主要集中于10 min、13 min、17 min和21 min,并且其疏水性氨基酸的含量得到显著富集,其中芳香族氨基酸Tyr、Phe的含量分别达10.46%和20.15%。

高效液相分子排阻色谱法分析重组人复合α干扰素稳定性

采用高效液相分子排阻色谱法(HPLC-SEC)分析不同温度、振荡时间和pH条件下缓冲液中重组人复合α干扰素(cIFN)单体降解和聚合程度,以研究cIFN的体外稳定性。分析表明,振荡会引起cIFN同时发生严重的降解和聚合,在振荡15 min后,聚合体质量分数23.8%,降解产物质量分数29.6%。温度和pH会引发严重降解和部分聚合,40°C下放置66 h会产生质量分数16.3%的聚合体和质量分数49.3%的降解产物;在pH 9放置66 h后会产生质量分数11.5%聚合体和质量分数37.7%的降解产物。研究显示HPLC-SEC方法能对不同环境条件下cIFN单体所发生的聚合和降解变化进行精确定量分析。不同环境下cIFN单体容易产生聚合体和降解产物表明:cIFN稳定性较差,蛋白质单体之间作用形式容易受到环境因素影响而发生改变。

分子排阻色谱法测定头孢克肟干混悬剂中高分子杂质的含量

目的采用分子排阻色谱法检查头孢克肟干混悬剂中的高分子杂质。方法色谱柱为TSK．GELG2500PWXL色谱柱（7．8mm×00mm，7μm），流动相为磷酸盐缓冲液（pH7．0）[0．05mol／L磷酸氢二钠溶液和0．05mol／L磷酸二氢钠溶液（61：39）]，流速为0．33mL／min，检测波长为254nm，以头孢克肟对照品外标法计算高分子杂质的含量。结果头孢克肟在2．0～2000μg／mL的浓度范围内，面积与浓度呈良好的线性关系（r=0．9996）；最小检出浓度为0．7μg／mL；高分子杂质与头孢克肟峰能有效分离，并先于主峰流出，方法专属性良好；高分子杂质在溶液中不稳定，样品需要临用现配。结论建立的方法快速准确，适用于头孢克肟干混悬剂高分子杂质的测定。

分子排阻色谱法测定螺旋藻多糖纯度和分子质量

使用分子排阻色谱法 ,用已知平均分子质量的硫酸化葡聚糖作为标准 ,分别用 5种不同的流动相 ,在ShodexSugarKS柱上测定螺旋藻多糖的纯度以及分子质量 ,使用线性回归得出校正曲线。并且通过对结果进行多种方法学的考查 。

分子排阻色谱硅质填料的制备及其对蛋白质的分离机理

利用自制的四种不同粒径的硅溶胶,通过堆积法来制备分子排阻色谱多孔硅质填料,该填料在进行化学键合改性后,形成二醇固定相。利用二醇固定相对蛋白质进行分离分析方面的研究。此填料粒径小,有利于蛋白质生物大分子的高效快速分离分析。

重组人成骨蛋白-1的离子交换及分子排阻色谱法纯化及其复性研究

经发酵大量表达重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)。SDS-PAGE发现rhOP-1表达量占细菌总蛋白的35%。菌体经裂解、洗涤后,用8mol/L尿素溶解包涵体,离心后提取目的蛋白。经离子交换色谱法对变性状态下的目的蛋白进行纯化,绝大部分杂蛋白被去除,目的蛋白纯度达93%以上。为进一步提高目的蛋白浓度,采用分子排阻色谱法对目的蛋白进行再次纯化,纯度达98%以上。利用降低尿素梯度的方法对纯化的蛋白进行复性,二聚体的含量在50%以上。Westernblot证明了复性后的目的蛋白以单体和有活性的二聚体的形式存在。

分子排阻色谱多检测器联用测定PTT相对分子质量

采用分子排阻色谱(SEC)法,利用SEC多检测联用仪,以六氟异丙醇为溶剂,以20 mmol/L的三氟乙酸钠的六氟异丙醇溶液为流动相,在柱流量为1 mL/min,温度为25℃条件下,测定了不同聚合时间制得的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的相对分子质量及其分布,并与乌氏黏度计法及核磁共振氢谱(~1H-NMR)法测定的PTT的数均相对分子质量(M_n)进行比较。结果表明:聚合时间分别为0.5,2.5,3.5 h的PTT,SEC法测得的M_n分别为29 570,57 790,76 240,相对分子质量分布指数分别为1.922,1.980,1.950,乌氏黏度法测得的M_n分别为30 790,61 270,82 000,~1H-NMR法测得的M_n分别为31 450,60 580,68 870;3种测试方法测得的PTT的M_n其相关系数接近1;SEC法可以准确地测定PTT的相对分子质量及其分布,方法高效、便捷。

分子排阻色谱法测定头孢克洛胶囊中高分子杂质的含量

目的建立分子排阻色谱法测定头孢克洛胶囊中的高分子杂质。方法采用球状亲水硅胶柱(TSK-GEL?G2500PWXL色谱柱,7.8mm×300mm,7μm),流动相为磷酸盐缓冲液(p H7.0)[0.02mol/L磷酸氢二钠溶液和0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(95:5)为流动相,流速为0.8m L/min,检测波长为265nm,以头孢克洛对照品外标法计算高分子杂质的含量。结果头孢克洛在0.532~21.280μg/m L的浓度范围内,面积与浓度呈良好的线性关系(r=0.9999);最小检出浓度为0.161μg/m L;高分子杂质与头孢克洛峰能有效分离,并先于主峰流出,方法专属性良好。结论该方法适于测定头孢克洛胶囊中高分子杂质,灵敏度高,重复性好,操作简便。

分子排阻色谱法测定硫酸头孢匹罗中聚合物杂质

目的建立适用于硫酸头孢匹罗中聚合物杂质含量测定的分析方法。方法采用Sephadex G-10凝胶柱进行分子排阻色谱分析,比较不同的洗脱条件。结果确定了Sephadex G-10凝胶的分离条件,检测方法符合杂质定量测定的要求。结论本法操作简便,重复性好,可作为硫酸头孢匹罗中聚合物杂质的含量测定方法。

分子排阻色谱分离蛋白质的研究

本文介绍自制的高效分子排阻色谱硅质填料对生物大分子的分离情况，并讨论键合剂KH-560键合情况。实验证明，色谱峰的顺序符合分子排阻洗脱行为。

离子交换层析结合分子排阻色谱法测定注射用尿激酶中分子组分比

目的:建立测定注射用尿激酶分子组分比的离子交换层析样品前处理方法结合分子排阻色谱法的分析方法,以解决长期以来制剂标准中无法控制分子组分比的难题,并对国内6家企业的产品质量进行了考察。方法:根据尿激酶与人血白蛋白等电点的差异,通过离子交换层析去除样品中人血白蛋白辅料的干扰,采用分子排阻色谱法测定。采用TSKgel G2000SWXL色谱柱(300 mm×7.8 mm, 5μm),流动相为0.1 mol·L^(-1)磷酸二氢钠缓冲液(pH 3.0),流速为0.5 mL·min^(-1),柱温为35℃,检测波长为280 nm,进样量为50μL。结果:尿激酶质量浓度在0.05~5.1 mg·mL^(-1)范围内,高分子量尿激酶与低分子量尿激酶线性关系均良好(r≥0.998 0);检测限分别为1.5μg·mL^(-1)与5.1μg·mL^(-1),定量限分别为5.1μg·mL^(-1)与16.9μg·mL^(-1);精密度、重复性、24 h稳定性试验的RSD均<4.0%;方法的回收率为92.5%~97.0%;18批样品中高分子量尿激酶与低分子量尿激酶的相对含量范围分别为82.8%~96.5%与3.5%~17.2%。结论:建立的离子交换层析结合分子排阻色谱法可用于注射用尿激酶中分子组分比的测定,弥补了注射用尿激酶现行国家标准中分子组分比测定的空白。

高效分子排阻色谱法同时测定白及多糖分子量和含量

目的:建立同时测定白及多糖分子量和含量的高效分子排阻色谱分析方法。方法:采用TSK-gel G4000 PWXL色谱柱(10μm,7.8 mm×300 mm),流动相为纯水,流速0.6 mL·min-1,柱温30℃,示差折光检测器检测。结果:白及多糖重均分子量的线性范围为24.17～178.0 k(R2=0.9943),含量测定线性范围为8.22～20.55.mg·mL-1(R2=0.9992),分子量、含量精密度试验RSD分别为0.11%和0.96%(n=6),重复性RSD为0.28%和1.1%(n=5)。结论:该方法简便快速,结果准确,重复性好,可作为白及多糖分子量和含量测定的有效方法。

分子排阻色谱法测定注射用头孢呋辛钠舒巴坦钠中的高分子杂质

目的:建立测定注射用头孢呋辛钠舒巴坦钠(3∶1)中高分子杂质的方法。方法:采用Superdex peptide 10/300 GL凝胶色谱柱,以pH7.0的磷酸盐缓冲液[0.025 mol.L-1磷酸氢二钠溶液-0.025 mol.L-1磷酸二氢钠溶液(61∶39)]-乙腈(70∶30)为流动相,流速1 mL.min-1,检测波长254 nm,主成分自身对照法定量。结果:头孢呋辛高分子杂质与头孢呋辛能较好分离,高分子杂质在进样量为含头孢呋辛50～100μg范围内线性关系良好(r=0.9991),重复性较好(RSD=0.88%,n=5)。结论:所用方法简便,结果可靠,可以用于注射用头孢呋辛钠舒巴坦钠(3∶1)中高分子杂质的检测。

双波长分子排阻色谱测定半胱氨酸偶联一甲基澳瑞他汀E抗体药物偶联物的药物抗体偶联比

目的:建立双波长分子排阻色谱(SEC)测定抗体药物偶联物(ADC)的药物抗体偶联比(DAR)的方法。方法:采用凝胶色谱柱,柱温25℃,以0.1 mol·L^(-1)磷酸盐-0.1 mol·L^(-1)氯化钠缓冲液为流动相对100μg样品进行等度洗脱,流速1.0 mL·min^(-1),在248 nm及280 nm双波长下分别对ADC的小分子药物和抗体进行检测;采用紫外分光光度计在248 nm及280 nm处进行吸收度测量。结果:双波长SEC可准确地对ADC的DAR进行测定,测得的DAR为4.17,RSD为0.24%;紫外分光光度(UV)法测得的DAR为3.97,RSD为2.8%。结论:双波长SEC检测可用于ADC样品的DAR测定,同时可对样品的大小异构体进行分析。SEC及UV 2种方法测得的DAR结果相似,都可用于ADC的药物抗体偶联比分析。

分子排阻色谱(SEC)分离纯化口蹄疫病毒及其病毒样颗粒的比较

口蹄疫(FMD)是一种世界范围内的烈性偶蹄动物传染病。传统口蹄疫灭活疫苗可以降低疾病发病率,是目前预防口蹄疫的重要手段之一,但灭活疫苗存在病毒逃逸等生物安全问题,已经不适应我国重大疫病逐步净化的方针政策。口蹄疫病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)仅由病毒结构蛋白组成,不含遗传物质,是一种与天然病毒形态最为接近的抗原,其免疫原性与天然病毒相似,被视为安全性更高的疫苗。因此,FMDV-VLPs疫苗的纯化尤为重要。本文通过分子排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)系统对大肠杆菌组装的FMDV-VLPs进行纯化条件摸索。以FMDV为对照,对纯化后的FMDV-VLPs进行表征,结果显示,大肠杆菌组装的FMDV-VLPs与对照样品出峰位置基本一致,且粒径均在20~30 nm,同时初步计算出大肠杆菌组装效率大概为31.4%。该纯化过程具有操作简单、易于放大并且能够检测粒子大小等优点,可以使FMDV-VLPs疫苗更适合产业化生产以及更接近临床应用。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱主峰右侧峰2蛋白鉴定

目的对冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱(size exclusion chromatograghy-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)主峰右侧峰2蛋白进行鉴定,以明确该峰的蛋白成分,保证疫苗质量。方法将冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)进行SEC-HPLC分析,收集主峰右侧峰2,经超滤浓缩后,进行二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)还原、碘代乙酰胺(iodoacetamide,IAM)烷基化和胰蛋白酶(Trypsin)酶解,产物进行nanoLC-MS/MS串联质谱分析。结果冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2成功鉴定4个蛋白,单个蛋白匹配肽段数在59~79个之间;单个蛋白匹配特征肽段种数在6~12种之间;单个蛋白匹配特征肽段检出次数在20~36次之间;鉴定蛋白的序列覆盖率在37.40%~64.31%之间。参与统计的肽段共280个,质谱偏差均小于0.15 Da。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2均来源于狂犬病病毒株4aGV,为疫苗颗粒解离物。

HPMEC-ELSD法检测注射用益气复脉(冻干)大分子物质

目的:建立一种利用HPMEC-ELSD检测注射用益气复脉(冻干)(YQFM)中高分子物质的方法。方法:采用UltrahydrogelTMlinear凝胶色谱柱,以0.02%甲酸水溶液为流动相,流量为0.6 ml/min,柱温为35℃,进样体积为10μl,ELSD(不分离模式,漂移管温度为105℃,压缩空气流量为2.5 L/min,增益值为1)建立大分子物质检测方法,并对10批YQFM进行大分子物质的检测。结果:该方法的专属性强、线性(Y=-0.5236 X+11.582,r=1.0000,线性范围为1027.5~13968 Da)、精密度(A的RSD≤0.7%、t_(R)的RSD≤0.1%)、重复性(A的RSD≤1.1%、t_(R)的RSD≤0.1%)、稳定性(48 h t_(R)的RSD≤0.1%)和方法耐用性良好。10批YQFM中均未检出大分子物质(分子量≥10000 Da)。结论:该方法简便、快捷,可作为YQFM中大分子物质的检测方法,亦可为其他品种的中药注射剂大分子物质检测提供借鉴。

离子交换色谱分离海洋胶原肽及其抗氧化活性研究

以工业化生产的海洋鱼皮胶原肽为研究对象,研究了从中分离抗氧化活性肽的方法。分别探索了分子排阻色谱和离子交换色谱直接梯度洗脱以及先等度洗脱,再梯度洗脱3种洗脱方法的分离效果,发现离子交换色谱先等度洗脱,再梯度洗脱分离效果最好,共分成5个洗脱峰。优化出此方法下的最佳洗脱液pH为5.5,最佳上样量为50mg。在优化的分离条件下分离并富集样品,脱盐后测定分离前后抗氧化活性,与原胶原肽相比,3#、4#、5#峰均显示出较强的抗氧化活性,其中3#峰活性最强,提高了10.6倍。这对工业化生产高抗氧化活性肽具有一定参考价值。