H_5N_1亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及分子进化分析

用RT-PCR法,以1株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NP全基因cDNA。将NPcDNA克隆于pMD18 T载体,并对其进行测序。测序结果表明:所克隆的NP基因全长1542bp,该核苷酸的片段包含了核蛋白完整阅读框架,其中编码区为1497个核苷酸,编码498个氨基酸。将其序列与6株A型流感病毒NP基因序列进行比较,各毒株之间NP基因核苷酸序列同源性为92 5%～95 9%,编码的氨基酸同源性为97 0%～98 4%。通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。

固始鸭白细胞介素-18全基因克隆与分子进化分析

根据GenBank发表的鸭IL-18cDNA基因序列设计、合成一对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如PHA等刺激脾淋巴细胞,直接提取脾淋巴细胞总RNA,扩增固始鸭IL-18基因,并克隆、测序。测序结果表明固始鸭IL-18基因全序列为610bp,包含1个完整阅读框,编码1条由200个氨基酸残基组成的多肽。序列分析发现,固始鸭IL-18基因与GenBank中两条鸭IL-18基因(AF336122和DQ490137)核苷酸同源性分别为98.8%、99.8%,与AF336122有5个碱基发生非同义变异,2个碱基为同义变异,氨基酸同源性为97.5%,与DQ490137有一个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为99.5%。固始鸭IL-18前体蛋白第30位谷氨酸处有一个IL-1β转换酶的caspase-1切割位点及在人和其他动物中已证实的IL-1标签序列,推测鸭IL-18成熟蛋白由170个氨基酸组成。固始鸭与人和其他动物的IL-18基因进化分析表明,IL-18基因存在着种的多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。

固氮基因的分子进化分析

从GenBank数据库获取固氮微生物和固氮植物的固氮基因序列(固氮微生物包括AE006469等15条序列,固氮植物AF013594等22条序列),利用邻接法从同一固氮微生物的固氮基因、同种固氮基因在不同固氮微生物和不同固氮植物3个方面构建分子进化树,结果显示:Sinorhizobium meliloti 1021固氮基因进化树中,lpsL和exoA基因为一个分枝,nodD、nifH和fixA基因为一个分枝,由于缺乏数据其它固氮微生物的固氮基因进化是否有上述规律有待进一步的研究;固氮微生物固氮基因(nifH)进化树分为4枝,各种根瘤菌分为一枝,弗兰克氏菌分为一枝,肺炎克氏杆菌和满江红鱼腥藻独自为一枝;固氮植物固氮基因(enod40)进化树分为4个分枝,分别为豆科、茄科、禾本科和木麻黄科,与APGIII的分类基本吻合。研究从整体上了解了固氮基因在固氮微生物和固氮植物的进化历史,为以后固氮微生物和固氮植物的固氮基因的进一步研究提供理论依据,也便于固氮基因在农业等实际应用方面提供参考依据。

H5N1亚型禽流感病毒M基因的克隆与分子进化分析

以一株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板，用RT-PCR方法，扩增M基因全长，将PCR产物克隆于pMD18-T载体，测序结果表明所克隆的982个核苷酸的片段包含了M1和M2基因的完整阅读框架，通过软件推导M1和M2基因分别编码252和97个氨基酸，将M全长序列与Genbank收录的10株H5N1亚型流感病毒M基因序列进行比较，病毒株之间M基因核苷酸序列同源性为92．3％～99．3％，编码的两个蛋白M1和M2氨基酸序列间同源性分别为为96．0％-98．8％和92．9％～99％，分子进化分析揭示了病毒株间的亲源关系．

鸽源冠状病毒PSH中国分离株S1基因克隆及分子进化分析

对分离鉴定的鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白S1基因进行RT-PCR法扩增、克隆和序列测定分析.结果表明其S1基因由1 626个核苷酸组成,编码541个氨基酸,S蛋白的切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸（RRFRR）,与常见的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S蛋白切割识别位点相似（RRF/SRR）.该病毒与火鸡蓝冠病病毒（TCV）Gh、G1株S1基因推导的氨基酸同源性仅为24.7%、25%,而与IBV H52、H120、M41、Beau、Conn、Gray、Hotel、SH1、SH2、SH5、SH6基因推导的氨基酸同源性在75.0%～99.6%,其中与SH2、SH5的氨基酸同源性更是达到了99.6%,进一步证明该冠状病毒可能来源于IBV.

异形同刺线虫形态学鉴定及基于核糖体ITS序列分子进化分析研究

对采自黑龙江省某鹅场莱茵鹅盲肠内的线虫进行形态学鉴定,然后采取PCR方法扩增虫体核糖体ITS序列,进行序列分析并以ITS序列为标记基因构建系统发生树,分析该线虫与其他虫体的进化关系。结果表明,所分离的虫体为异形同刺线虫(Ganguleterakis dispar),该线虫ITS序列全长为957 bp,其中ITS-1,5.8S和ITS-2大小分别为424 bp,157 bp和376 bp。应用BI,MP,NJ 3种方法构建系统发生树结果相同,在尖尾目线虫的分支中,本研究的5条异形同刺线虫聚集在一起,与同科的鸡异刺线虫亲缘关系较海绵异刺线虫和Heterakis dahomensis接近。该结果为禽类异形同刺线虫病的分子鉴别诊断方法提供了参考。

柑橘类植物和其它植物的GPAT和SOD基因分子进化分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因和超氧化物歧化酶(SOD)基因是与植物抗寒和抗逆密切相关的2个基因。为了研究柑橘类植物之间以及和其它植物之间上述两基因的分子进化的异同,已经获得的数种柑橘类植物的GPAT基因、SOD基因氨基酸序列和通过检索GenBank数据库获得的相关序列为试验数据,使用PAUP4.0软件,通过最大简约法,分别构建GPAT基因、Fe/Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因和总SOD基因的分子系统进化树。GPAT基因分子系统进化树分析结果表明,GPAT基因在单子叶和双子叶植物中的进化差异不大,在柑橘类植物中的进化差异较大;Fe/Mn-SOD基因分子系统进化树分析结果表明,该基因分子进化与植物自身的抗逆能力有密切关系;Cu/Zn-SOD基因分子系统进化树分析结果表明,该基因在进化上是相当保守的。总SOD基因分子系统进化树分析结果表明,SOD基因的进化和聚类并不是以植物的科属是否相同或相近为依据的,而是以该基因所结合的金属离子的不同来分类的;Cu/Zn-SOD基因和Fe/Mn-SOD基因来源于不同的祖先基因,前者较后者保守。

H_5N_1亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及分子进化分析

用RT＿PCR法,以1株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NP全基因cDNA。将cDNA克隆于pMD18＿T载体,并对其进行测序。测序结果表明所克隆的1542个核苷酸的片段包含了核蛋白完整阅读框架,其中编码区为1497个核苷酸,编码498个氨基酸。将其序列与6株A型流感病毒NP基因序列进行比较,各毒株之间NP基因核苷酸序列同源性为92 5%～95 9%,编码的氨基酸同源性为97 0%～98 4%。本研究通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。

中国H5N1禽流感病毒HA基因的分子进化分析

为了阐明中国H5N1禽流感病毒血凝素(HA)基因的分子进化规律,从GenBank下载中国近年来分离的27株禽流感H5N1病毒的HA基因,利用LaserGene软件包中的EditSeq程序剪切共同序列并翻译成氨基酸序列,与DNAMAN软件进行比对,并以LaserGene软件包中的MegAlign程序构建分子进化树,结合背景资料分析其传播流行规律。结果显示:①在HA裂解位点上游毗邻的位置,gdch04、gddu04、gxch0405、gxdu05、gxqu0502、hkcph05、stch05、stqu05、ynch0502株都缺失了三个碱基;②27株毒株在HA裂解位点上游毗邻的位置存在多个连续的碱性氨基酸;③来自广西的gxch0405、gxdu05、gxqu0502和来自香港的hkcph05、hkgh04的序列同源性很高,很可能与苍鹭的迁移有关;④来自广西的gxqu0502和来自香港的hkcph05亲源关系很近,很可能来自同一祖先。

真核生物中支架蛋白家族(IQGAP family)的分子进化分析

支架蛋白家族(IQGAP family)广泛存在于真核生物中,在细胞的信号转导、骨架运动、细胞分裂的过程中都有着重要功能.研究分析IQGAP蛋白家族的分子进化,有助于深入全面地了解整个IQGAP蛋白家族在不同物种中功能.通过使用相关数据库,在35个真核生物物种中检索到了70个支架蛋白家族成员的序列信息,并对其进行了系统的分子进化研究.我们发现:支架蛋白家族基因广泛存在于后生动物(Metazoan)、真菌(Fungi)、变形虫界(Amoebozoa)以及其他一些真核生物中,提示支架蛋白存在于最后的真核生物的共同祖先(Last Eukaryotic Common Ancestor,LECA).系统发育分析表明脊椎动物的IQGAP蛋白和非脊椎动物中代表性IQGAP基因共享一个共同的祖先基因,单个的IQGAP祖先基因在早期脊椎动物中(在四足总纲和硬骨鱼纲的分离之前),发生了两次基因复制事件,导致现存的脊椎动物中3组IQGAP基因(IQGAP1,IQGAP2,IQGAP3)产生.

辽宁口岸淡色库蚊拟除虫菊酯击倒抗性基因的AS-PCR检测和分子进化分析

对辽宁地区大连、丹东、朝阳3个国境口岸淡色库蚊击倒抗性(Knockdown resistance, kdr)情况进行检测分析,了解其分子进化关系,评估其对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性风险。采用AS-PCR扩增技术检测淡色库蚊的kdr等位基因突变频率,对敏感型和抗性型淡色库蚊的特异性基因片段进行多序列比对及分子进化分析。在检测的300只淡色库蚊中,大连、丹东、朝阳国境口岸淡色库蚊的kdr等位基因突变频率分别为13.00%、19.50%、18.80%。多序列比对确定口岸抗性型淡色库蚊钠通道基因L1014位点碱基由“A”突变为“T”。系统进化树显示3个国境口岸淡色库蚊亲缘关系较近。大连、丹东和朝阳3个国境口岸的淡色库蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂在不同程度上已产生了一定的抗药性,因此应合理使用拟除虫菊酯类杀虫剂,加强国境口岸媒介生物抗药性的监测,延缓抗性的快速发展,为建立辽宁口岸病媒生物抗药性数据库和蚊媒有针对性监管提供依据。

浙江省汉坦病毒基因分子进化分析

为了分析浙江省汉坦病毒分子流行病学的特点,本文应用分子生物学软件对1981～2007年从浙江省不同地区不同宿主分离的12株汉坦病毒的S、M基因序列进行分子进化分析,结果显示:浙江省属汉滩(HTN)型和汉城(SEO)型的混合型疫区,病毒的基因差异和亲缘远近关系主要表现在地区性,而与病毒分离的年代与宿主关系并不大,表现出明显的地理聚集现象,该现象在HTNV中的表现尤为明显,同一地区分离的病毒表现为较高的基因同源性,系统进化树上分布于同一或临近分支。另外发现分离自浙江省建德地区的Gou3和ZJ5株在SEOV进化枝中构成一独立分支,而且与国内外SEOV其他毒株的基因差异均较大,在浙江省建德地区存在着SOEV的特殊亚型病毒。

2007年北京市急性出血性结膜炎的病原与分子进化分析

2007年北京市发生了急性出血性结膜炎（Acute Hemorrhagic Conjunctivitis,AHC）疫情。为鉴定引起这次疫情的致病病原体,采集北京市门诊就诊的AHC患者眼结膜拭子标本共57份,使用PCR或RT-PCR法分别检测临床标本中腺病毒、人肠道病毒70型（Human Enterovirus 70,HEV70）和柯萨奇病毒A组24型变种（CoxsackievirusA24 variant,CVA24v）的基因,其中有38份检测结果为CVA24v阳性,阳性率为66.7%,而腺病毒和HEV70检测结果均为阴性,说明引起本次AHC流行的病原体是CVA24v。使用HEp-2细胞共分离到9株病毒,通过分子定型均鉴定为CVA24v,对9株CVA24v进行全长VP1区扩增和核苷酸序列测定和分析后,发现除0744/BJ/CHN/2007株之外,其它8株在全长VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上差异都很小,同源性分别大于99.6%和100.0%,而0744/BJ/CHN/2007株与其它8株CVA24v的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.8%~97.2%和99.7%。进化树图显示,2007年北京CVA24v分离株与基因群I中的代表株聚为一簇,代表了基因群I中的第四和第五进化分支,说明本次流行至少存在两个传播链。相对于CVA24v的3C区而言,VP1区是进行分子流行病学研究的更为严谨的靶序列,加强对CVA24v的血清流行病学和分子流行病学监测和研究,了解CVA24v的基因特征和分子进化,对预防和控制CVA24v在中国的流行具有重要意义。

肺炎克雷伯菌老年患者分离株耐药性与膜孔蛋白基因分子进化分析

目的了解肺炎克雷伯菌（KPN）老年患者分离株抗菌药物耐药状况和膜孔蛋白基因分子进化状况。方法对38株分离自老年患者的KPN进行了20种抗菌药物敏感性检测和膜孔蛋白基因（ompK36）测序及分子进化分析。结果38株分离自老年患者的KPN对抗菌药物敏感性低，38株均检出ompK36基因，产物经测序比对，各株分别获得623656bp同源序列；敏感株（2号株）为650bp，8、9、11、23号株获得656bp，为CGGCGA小片段插入；其余各株分别小片段缺失。结论38株分离自老年患者的KPN连续分离株对20种抗菌药物敏感性低，KPN连续分离株膜孔蛋白ompK36基因具有较好的多态性。

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒分子进化分析

2005年在广东进行流行病学调查时分离到一株鹦鹉源禽流感病毒,经鉴定为H5N2亚型禽流感病毒(A/Parrot/Guangdong/268/2005)。该毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为RETRGLF,只含有一个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点附近氨基酸序列的分子特征;与H5N2亚型禽流感代表毒株相比,该毒株HA和NA基因的糖基化位点、HA基因的受体结合位点编码区、NA基因的耐药性位点均未发生变异。将该毒株全基因组序列与GenBank已公布的19株H5N2亚型禽流感病毒株的相应序列进行比较分析并绘制系统进化树后发现:其与低致病性禽流感毒株A/Pheasant/NJ/1355/1998(H5N2)-like的亲缘关系最近,位于以A/Chicken/Pennsylvania/1/1983(H5N2)为代表的美洲进化分支。

猪獾苦味受体T2R2基因的分子克隆与进化分析

苦味的感知是机体有效的自我保护机制之一。文章采用PCR和克隆测序方法首次从猪獾基因组中获得一全长为1169bp的苦味受体T2R2基因DNA序列(GenBank登录号:FJ812727)。该序列含有完整的1个外显子(无内含子),大小为915bp,编码304个氨基酸残基。其蛋白质等电点为9.76,分子量为34.74kDa。拓扑结构预测显示猪獾T2R2蛋白上含有N?糖基化位点、N-肉豆蔻酰化位点各1个,蛋白激酶C磷酸化位点2个。整个蛋白质多肽链含有7个跨膜螺旋区,4个细胞外区和4个细胞内区。亲水性/疏水性分析表明,猪獾T2R2蛋白质为一疏水性蛋白,其亲水性区段所占比例较小。种间相似性比较显示,猪獾T2R2基因与犬、猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的T2R2基因cDNA序列相似性分别为91.4%、90.6%、84.4%、85.4%、83.8%、72.1%,氨基酸序列相似性分别为85.5%、85.8%、74.0%、77.6%、75.3%、61.5%。核苷酸替换计算和选择性检验结果表明,猪獾T2R2基因与犬、猫、牛、马、黑猩猩和小鼠间存在着强烈的纯净化选择(Purifying selection),即强烈的功能束缚(Functional constraint),进一步分析发现该选择作用实际上主要存在于跨膜区。猪獾、犬、猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的T2R2基因外显子核苷酸序列构建的基因树与其物种树的拓扑结构是相一致的,表明T2R2基因适合于构建不同物种间的系统进化树。

广东省鸡传染性贫血病毒编码区基因的克隆与分子进化分析

为了解鸡传染性贫血病毒（chickenanemiavirus，CAV）广东分离株变异情况，通过PCR方-法克隆了于2012年分离到的10株cAV的编码区序列，并对其进行了测序及分子进化分析。结果显示，广东CAV分离株编码区全长1823bp，含有3个互相重叠的开放阅读框（ORF）。序列分析表明，广东省CAV分离株与GenBank上已发表的其他36株cAV比较，VP1核苷酸的同源性在94．1％～99．2％之间，推导出的氨基酸的同源性在95．3％～99．3％之间；VP2的核苷酸同源性在98．2％～100％之间，推导出的氨基酸的同源性在95．9％～99．5％之间；VP3的核苷酸同源性在97．8％～100％之间，推导出的氨基酸的同源性在95．1％～99．2％之间；VPl蛋白共有17个位点发生了变异，VP2蛋白共有11个位点发生了变异，VP3蛋白共有6个位点发生了变异。分子进化分析显示，10株CAV广东分离株主要位于两个分支，其中9株CAV分离株与GenBank上已发表的35株CAV处于一个大分支，而GI）IN一12与分离株KC414026处于另外一个小分支，由此得出其中9株广东CAV分离株是目前主要的流行毒株。

2019年广西鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及F基因分子进化分析

为了解广西鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1)分离株的基因亚型及遗传进化,2019年从广西鸽场疑似感染PPMV-1的送检临床样品进行病毒分离和鉴定,并对其进行F基因的测序以及系统发育和分子钟的分析。结果显示,从送检样品分离3株病毒株,分别命名为Pi/CH/GX1101/2019,Pi/CH/GX1201/2019和Pi/CH/GX1202/2019。测序结果表明其F基因编码区长度均为1662核苷酸(nt),编码553氨基酸(aa)。分离株的F蛋白裂解位点为^(112)RRQKRF^(117),符合强毒株特征;系统发育分析表明3株毒株属于两个基因亚型:Ⅵ.2.1.1.2.1亚型(原Ⅵj)和Ⅵ.2.1.1.2.2亚型(原Ⅵk);分子钟分析结果显示中国Ⅵ.2.1.1.2.1亚型和Ⅵ.2.1.1.2.2亚型毒株大约在20世纪80年代开始出现进化分歧;Ⅵ.2.1.1.2.1亚型的Pi/CH/GX1201/2019和Pi/CH/GX1202/2019与位于进化枝低节点的野鸟源参考毒株W4的亲缘关系较近,同在一个分支中,而Ⅵ.2.1.1.2.2亚型的Pi/CH/GX1101/2019毒株与进化枝低节点的2株野鸟源参考毒株Grey heron/CH/GD/GZ333/2015和European turtle dove/CH/GD/GZ23/2015的亲缘关系相近,同在一个小簇中。研究结果证明广西鸽群主要流行Ⅵ.2.1.1.2.1亚型和Ⅵ.2.1.1.2.2亚型的PPMV-1,并推测存在从野鸟传入商业鸽群的风险。

大弹涂鱼TLR基因分子进化研究及其在鳗弧菌胁迫后的表达分析

大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)是一种生活在潮间带的淤泥滩和红树林等两栖环境中的鱼类,其免疫系统面临比水生生活更大的选择压力。Toll样受体基因(简称TLR)是重要的先天免疫成员,一直是鱼类分子免疫学的研究热点之一。为了探究大弹涂鱼TLR基因是否因为其独特的生活环境而产生适应性进化以及其TLR基因在受到细菌攻击后的免疫应答模式,本研究从大弹涂鱼皮肤转录组中获得了TLR5, TLR8和TLR9完整序列以及TLR3和TLR7部分序列,采用分子生物信息学对大弹涂鱼TLR5, TLR8和TLR9基因序列以及氨基酸序列进行了分析,并根据所构建的系统发育树对5个TLR基因进行了分子进化分析,采用荧光定量PCR方法对大弹涂鱼5个TLR基因的组织表达分布和鳗弧菌攻击后5个TLR基因的免疫应答模式开展了研究。结果显示, TLR5基因全长3071 bp,包括长度为2646 bp的编码区,共编码882个氨基酸;TLR8基因全长3175 bp,包括长度为3033 bp的编码区,共编码1011个氨基酸;TLR9基因全长3398 bp,编码区长度为3093 bp,共编码1031个氨基酸。大弹涂鱼3个TLR基因与其他物种的TLR基因结构相似,具有高度保守性。位点模型结果表明,鱼类TLR3, TLR5和TLR8是高度保守的,而TLR7和TLR9在长期进化过程中产生了适应性进化;而进化枝-位点模型结果表明,为了适应更加复杂多变的两栖环境,大弹涂鱼TLR9基因可能产生了适应性进化。大弹涂鱼5个TLR基因在8个健康组织(肠,眼,肾,肝,脑,肌肉,脾和皮肤)中均有表达,在肝脏和脾脏中的表达量较高。在受到鳗弧菌(Vibrio anguillarum)攻击后的免疫表达模式表明了大弹涂鱼5个TLR基因在应对细菌入侵时起到了重要作用。

一株重组鸭源H5N2亚型禽流感病毒分子进化分析

2016年对武汉地区家禽市场进行常规流感监测,分离鉴定到1株H5N2亚型禽流感病毒。本研究对该株病毒进行了全基因组测序,分子特征和遗传进化分析。结果显示该株病毒的HA基因属于Clade2.3.4.4分支,HA蛋白的裂解位点处具有多个连续碱性氨基酸,具备高致病性禽流感病毒的典型分子特征。序列比对分析显示该株病毒的各基因节段分别与H5不同亚型的禽流感病毒具有较高的相似性,推测该分离株为重组病毒。继续开展对家禽市场H5亚类流感病毒的分子流行病学调查,对研究高致病性流感病毒的变异和进化,以及对禽流感的综合防控有着重要的意义。