分支酶介入酸热法制备焦糊精的工艺优化

抗性糊精属于小分子、低热量的膳食纤维,被广泛应用于食品行业中,其中保健品应用市场最大,占比38.7%。但目前高温酸热生产抗性糊精普遍得率低、副产物多。研究以低水分玉米淀粉为原料利用高温酸热法制备焦糊精,通过单因素实验优化工艺,确定最佳工艺参数,细化操化手法,增加吸酸预反应过程,得率可达61.9%,在此基础上,引入淀粉分支酶作用焦糊精,催化α-1,4向α-1,6糖苷键转化,得率可达68.5%,葡萄糖聚合度有所增加,抗性含量提高1.2%。

芋淀粉分支酶(SBE)基因的鉴定、生物信息学及表达分析

淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)在支链淀粉生物合成中发挥关键作用,直接影响淀粉的含量和结构。芋(Colocasia esculenta)是一种主要的块茎类作物,在世界上热带和亚热带地区广泛栽培。目前,SBE在芋中的研究很少,对SBE基因在芋中的数量、分子结构特征和表达模式还不清楚。本研究首次对芋SBE基因进行了全面分析,鉴定了3个SBE基因(CeSBE1、CeSBE2和CeSBE3)。CeSBE1、CeSBE2和CeSBE3蛋白氨基酸数量分别为828、845和598,分子质量分别为92956.71、95625.13、69169.16 Da,等电点分别为5.22、5.41和7.36。系统进化分析显示3个CeSBE蛋白分别在3个不同的亚群。基因结构分析显示,CeSBE1、CeSBE2和CeSBE3外显子数量分别为16、22、10;保守结构域分析表明,CeSBE1和CeSBE2均具有alpha-amylase_C和alpha-amylase结构域及7个motif,而CeSBE3具有alpha-amylase和CBM_48结构域及3个motif。CeSBE基因启动子区域顺式作用元件分析表明,共预测到55个顺式作用元件,其中29个具有功能注释,涉及光响应、激素响应、植物生长发育及环境压力等相关元件。在不同组织中,3个CeSBE基因均能在所有组织中表达,其中CeSBE2在球茎和叶片显著表达(P<0.05);在球茎不同发育阶段中,CeSBE2在所有的发育阶段均有较高的表达量,呈现先升高后降低的表达趋势,在球茎发育120 d的表达量达到峰值。球茎不同发育阶段总淀粉和支链淀粉含量增加与CeSBE2表达量趋势一致,说明CeSBE2可能是芋支链淀粉生物合成的关键基因。本研究结果可为芋的产量、品质和营养性状的遗传改良提供基础。

淀粉分支酶和去分支酶编码基因的功能

淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(DBE)是直接参与淀粉生物合成的5类酶中的2类关键酶,前者催化α(1-6)糖苷键分支点形成支链淀粉,后者水解葡萄糖苷链中α(1-6)糖苷键。文章概述了已克隆的编码SBE和DBE同种型编码基因及其在体内外的表达特征,并提出DBE多聚体酶的结构和功能将成为淀粉粒起始形成研究中的起点,SBEI和SBEII表达调控是支链淀粉分子改良的途径的看法。

花粉管通道法将淀粉分支酶基因反义表达载体转入玉米自交系的研究

实验主要利用花粉管通道技术将淀粉分支酶基因的反义表达载体转入玉米自交系中,同时探讨了不同导入时间、不同DNA浓度、不同导入量等对其转化率的影响,并从中得出花粉管通道法的最佳转化条件。同时将转化的玉米植株进行PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中,并得到了转化植株的种子。

RNAi沉默淀粉分支酶sbe3基因对水稻直链淀粉的影响

本研究利用RNAi技术,通过RT-PCR方法克隆出水稻淀粉分支酶sbe3基因片断,经两步组装法将sbe3基因片断分别正向、反向组装入pRNAi-ubi,成功构建sbe3基因RNAi转化载体pRNAi-ubi/sbe3。在农杆菌介导下,对粳稻中花11未成熟胚诱导的愈伤组织进行转化,通过PCR、Southern杂交鉴定获得一批转基因植株。半定量RT-PCR鉴定出转化苗T1代种子中sbe3基因表达被明显抑制,但只引起转基因水稻胚乳中直链淀粉含量少量的提高,说明采用RNAi仅沉默sbe3基因对水稻胚乳直链淀粉含量没有显著影响。

水稻分支酶基因Sbe1和Sbe3 cDNA的克隆及全序列分析

通过改良的 RT- PCR法合成了水稻未成熟种子胚乳 c DNA库 ,并以此为模板 ,用 PCR技术从粳稻品种武运粳 7号中克隆了分别编码淀粉分支酶 SBE 和 SBE 的 2个基因 Sbe1和 Sbe3。序列分析表明 ,克隆 Sbe1和 Sbe3基因的大小分别为 2 4 90 bp和 2 4 81bp,包含了基因完整的编码序列。 Sbe3基因与已发表基因全序列完全相同 ,同源性达 10 0 % ;Sbe1基因与已发表基因序列有 4个碱基不同 ,同源性为 99.84 % ,推导氨基酸序列的差异为

玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子的克隆和表达载体构建

以玉米基因组DNA为模板,通过LA-PCR技术扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并将其克隆到pMD18-TVector上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析并测序。结果表明,该启动子和Genbank中发表的玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%,克隆片段长为934bp。再将经BamHⅠ和HindⅢ双酶切得到的启动子片段克隆到相同酶酶切的pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb,并进行酶切鉴定和PCR检测。结果显示,启动子基因sbeⅡb已成功整合到植物表达载体pBI121上。序列中发现高等植物启动子所特有的基本核心序列和种子特异表达所需的特殊调控元件。

应用农杆菌介导法将淀粉分支酶基因反义表达载体转入玉米自交系的研究

以玉米自交系'综31'和'P12'的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对潮霉素的敏感性试验,确定了潮霉素50～70 mg/L为愈伤组织适宜选择压.利用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因的反义表达载体导入玉米自交系中,并对农杆菌转化系统的条件进行了研究.结果表明:采用EHA105的菌株振荡20h后,菌液OD值为0.5～0.6时侵染25min为农杆菌转化的最适条件.对转化的愈伤组织进行分化诱导出苗后进行PCR检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中,转化率最高达到5.3%,并得到了转化植株的种子.

测定淀粉分支酶活性方法的改进

以发育中的小麦籽粒为材料,对现有的淀粉分支酶活性测定方法从缓冲体系,酶液浓度、反应体系总体积、反应时间、到酶反应终止方式作了适当改进。改进后的酶活性测定方法能很好的区分不同小麦品种间的酶活性差异,实验重复性好,比原测定方法更快捷、省时、经济和易于操作。

高温胁迫下水稻胚乳淀粉分支酶各同工型基因的表达特征

以稻米品质温度敏感型的早籼稻品种浙辐49为材料,利用人工气候箱控温处理试验和实时荧光定量PCR技术,探讨了水稻发育胚乳中淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)的3种主要同工型基因(SBEⅠ、SBEⅢ和SBEⅣ)在不同温度处理下的相对表达量差异及动态变化特征。结果表明,高温处理对水稻胚乳中SBE基因的表达调控因其同工型的种类而异,SBEⅣ基因在高温处理下呈上调表达,而SBEⅠ和SBEⅢ基因在高温处理下的相对表达量则明显降低,表现为下调表达;与SBEⅣ等同工型相比,水稻胚乳中SBEⅠ基因对高温胁迫的表达响应相对更敏感。

植物淀粉分支酶基因的研究进展

淀粉分支酶(Starch branching enzyme,SBE)是直接参与淀粉生物合成的关键酶,它催化-α1,6糖苷键分支点形成支链淀粉。本文综述了SBE基因的分类、结构、同种型的功能、各同种型在不同组织和不同生育时期的表达特异性以及它们不同的功能、基因表达与淀粉合成的关系、SBE的应用等方面的研究进展,旨在为利用基因工程技术调控植物淀粉的含量与特性提供相关信息。

玉米淀粉分支酶基因的克隆与RNAi表达载体的构建

利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定玉米淀粉分支酶SBEⅡb的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从玉米自交系‘综31’中分别成功克隆出了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因的部分序列及其启动子序列,从大肠杆菌中成功克隆了木糖异构酶基因xylA作为筛选标记,构建了含有35S驱动的木糖异构酶基因和sbeⅡb启动子驱动的含有sbeⅡb目标序列的反向重复序列的表达载体pBAC413,并对玉米自交系实施转化。经PCR检测转基因玉米再生植株,初步判定目的序列已经成功整合到玉米再生植株的基因组中。

玉米淀粉分支酶基因片段的克隆和植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了玉米淀粉分支酶的cDNA基因片段,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析,测定了DNA全序列。结果表明:克隆片段全长为935bp。将反义+正义基因片段插入到pBI12135S启动子下,构建成表达质粒pCJSBE2b。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株。

农杆菌介导淀粉分支酶基因RNAi片段转化玉米的研究

以玉米自交系“178”和“R18红”的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对潮霉素的敏感性实验,确定了潮霉素15 mg/L^25 mg/L为愈伤组织适宜的选择压。利用农杆菌(Agrobacterium tum efaciens)介导将淀粉分支酶基因RNA干涉表达载体转入玉米自交系中,并对农杆菌转化系统的条件进行研究。结果表明:在感染液和共培培养基中分别都加入100μm ol/L乙酰丁香酮和50 mg/L抗坏血酸,农杆菌LBA4404的菌液OD600为0.6、侵染时间20 m in为农杆菌转化的最适条件。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中,转化率最高达到2.4%。

不同淀粉组分含量小麦品种灌浆过程中淀粉去分支酶的活性及类型

【目的】研究不同淀粉组分含量小麦品种灌浆过程中籽粒所含淀粉去分支酶的活性及类型,为研究其在小麦支链淀粉合成中的作用提供理论依据。【方法】利用非变性PAGE与HPLC技术,对糯麦1号、关东107、鲁麦21和济南16四个小麦品种灌浆过程中的淀粉去分支酶进行分析。【结果】在灌浆过程中,淀粉去分支酶的活性均呈单峰曲线变化,灌浆中期活性最大;淀粉去分支酶对底物支链淀粉均具有相似的酶解活性;对灌浆中期小麦淀粉去分支酶进行的纯化结果表明,小麦籽粒胚乳中也存在2种类型的淀粉去分支酶,一种是以极限糊精为特异性底物的极限糊精酶(Limit dextrinase),另一种是以支链淀粉为底物的异淀粉酶(Isoamylase)。【结论】虽然小麦淀粉组分含量不同,但所含的淀粉去分支酶却具有相似的活性变化,在体外对底物——支链淀粉也有相似的酶解活性。

小麦籽粒淀粉分支酶同工酶基因型与酶活性关系研究

测定了71个小麦品种的籽粒淀粉分支酶活性,并采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE),鉴定了分支酶同工酶的基因型,以明确小麦籽粒淀粉分支酶(SBE)各同工型等位基因的分布特点和基因型组成,阐明分支酶活性与分支酶同工酶基因型的相关性。结果表明,分支酶有SBEⅠ和SBEⅡ两个基因位点,SBEⅡ位点未显现多态性,SBEⅠ位点存在多样性。在SBEⅠ位点鉴定出A、B、Di和Dii共4个等位基因位点,各等位基因位点出现频率分别为9.9%、76.1%、95.8%和57.8%;共检测到9种基因型,其中基因型DiDiiB、DiB和DiDii有较高的分布频率,分别为45.1%、28.2%和8.5%。从单一位点分析,分支酶活性与SBEⅠ位点有显著的相关性,与SBEⅡ位点相关性不显著。由此可见,小麦籽粒胚乳淀粉分支酶同工酶不同基因位点和基因型对酶活性具有不同的遗传效应。

玉米淀粉分支酶SBEⅡb基因RNA干涉表达载体的构建和转化

应用聚合酶链式方应技术扩增玉米淀粉分支酶第20外显子155 bp的基因片段,并将其正向和反向克隆到pUCCRNA i载体上。利用pHMW.GUS与pCAMB IA1300作为桥梁载体,构建了含胚乳特异启动子和潮霉素筛选基因的RNA干涉表达载体pCAMB IA1300+HMW+2F。通过三亲杂交将pCAMB IA1300+HMW+2F表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404,对玉米自交系178进行遗传转化,通过抗性筛选和PCR检测,获得了4株PCR阳性苗。

玉米淀粉分支酶sbe2a基因反义载体的构建及其转基因初步研究

应用PCR技术克隆了玉米淀粉分支酶sbe2a基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并进行序列比对。结果表明:克隆片段长度为562 bp。将该基因反向插入到pWGLL载体Actin-pro启动子下游,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系"铁7922",经PCR检测初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。

粳稻杂种后代胚乳淀粉分支酶基因表达特性分析

选用籽粒直链淀粉含量有显著差异的亲本和杂种后代,分析籽粒灌浆过程中直链淀粉积累和淀粉分支酶活性以及淀粉分支酶基因mRNA表达量等变化特点。结果表明,直链淀粉含量高的亲本及后代在灌浆过程中合成和积累的直链淀粉量显著高于直链淀粉含量低的亲本及后代;直链淀粉含量高的亲本及后代的淀粉分支酶活性均比直链淀粉含量低的亲本及后代高,灌浆不同时期的籽粒直链淀粉含量与淀粉分支酶活性间均呈正相关;亲本及杂种后代籽粒OsSBE1和OsSBE3的mRNA表达量随灌浆进程逐渐增加,达到峰值后又逐渐下降,呈单峰曲线变化,其表达量峰值都出现在抽穗后17 d,在灌浆过程中胚乳OsSBE4基因的mRNA表达量相对比较小;杂种后代籽粒淀粉分支酶基因mRNA表达量随籽粒直链淀粉含量的变化发生变化,且能超亲表达;直链淀粉含量和淀粉分支酶活性高的基因型其SBE1和SBE3的mRNA表达量也高,低的基因型其mRNA表达量也低,SBE4的表达量与此相反。