大肠杆菌苯丙氨酸合成途径关键酶基因pheA的克隆与表达

为了通过基因工程手段来增加苯丙氨酸的生物产量，利用ＰＣＲ方法从大肠杆菌中克隆了抗反馈抑制突变型及野生型的ｐｈｅＡ基因，进行了核苷酸序列分析，并利用高效的原核表达载体ＰＢＶ２２０对ｐｈｅＡ基因编码的突变型及野生型分支酸变位酶／预苯酸脱水酶（ＣＭ／ＰＤ）进行了表达。序列分析表明突变型基因碱基第５８０位由Ｔ变为Ｃ，相应氨基酸由Ｖａｌ变为Ａｌａ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱扫描分析表明目的蛋白ＣＭ／ＰＤ的表达量占全菌体蛋白的４３％，占上清总蛋白的５７％。酶活性测定表明其ＣＭ和 ＰＤ活性分别提高了 １５．５和６．７倍，产酸量也有了一定的提高，为构建产苯丙氨酸的生物工程菌奠定了基础。

大肠杆菌CM/PDT抗反馈抑制突变体的构建及其性质

为了获得具有高催化活性且抗反馈抑制的大肠杆菌分支酸变位酶 预苯酸脱水酶 (chorismatemutase prephenatedehydrataseCM PDT) [EC5 .4 .99.5 EC4 .2 .1.5 1],通过相关菌种CM PDT氨基酸序列同源比较 ,寻找高度保守位点 .用定点突变及PCR法构建突变酶M1(缺失 30 4T、30 5G、Q30 6K)、M2 (缺失W 338)、M3(缺失 30 1～ 386位氨基酸 )、M32 9(E32 9A)和M374 (C374A) ,野生型及各突变型基因与pET2 8a(+ )载体连接后 ,表达融合蛋白 .在非变性条件下 ,由TALON金属螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白 .酶活性测定表明 ,突变体M3的PDT活性下降为野生型活性的 2 9% ,但保持了CM活性 .突变体M374保持了CM ,PDT两种酶的活性 ,突变体M1、M2、M32 9的CM ,PDT活性有一定程度的提高 .酶抗反馈抑制作用检测表明 ,突变体M3、M374解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 ,M1、M2、M32 9部分解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 .与含野生型pheA基因的E .coliBL2 1菌株相比 ,含突变基因的E .coliBL2 1菌株对 10mmol L的苯丙氨酸代谢类似物具有强的抗反馈抑制作用 ,其中M1,M2 ,M3对 2 0mmol

大肠杆菌T蛋白的高效表达和分离纯化

目的 构建高效表达菌株 ,以大量表达大肠杆菌T蛋白 ,为后续的新药作用靶点研究提供活性蛋白质材料。方法 利用高效表达质粒pET2 6b+ 克隆了大肠杆菌TyrA基因 ,并在其C端融合了一个由 6个组氨酸组成的his tag以利分离纯化。 结果 T蛋白的表达量达每 1L培养液 2 0 0mg ,细胞裂解液经一次his tag亲和柱色谱 ,纯度达 98% ,分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶的比活性分别为 130和 98U·mg-1。结论 本法表达的大肠杆菌T蛋白 ,表达量高 ,纯化容易 ,酶活性正常 ,为进一步研究T蛋白的结构与功能 ,并进行新药设计奠定了基础。

基于结构域活性分析的大肠杆菌T蛋白结构研究

大肠杆菌T蛋白含有三个结构域:分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶和调节结构域。文章作者分段克隆了T蛋白的分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶和调节结构域等片段,并对其进行了活性研究。研究发现,定位于N末端的分支酸变位酶结构域的比活性虽然不高,而稳定性较好;同时拥有调节结构域和预苯酸脱氢酶结构域的C末端片段,其预苯酸脱氢酶比活性的剩余百分率虽然高于分支酸变位酶结构域,但稳定性较差。作者进而表达了C末端切除38个氨基酸的T/1-336片段,发现预苯酸脱氢酶活性彻底丧失,而其分支酸变位酶和调节结构域的活性却基本保留。这说明T蛋白中分支酸变位酶结构域拥有一个相对独立、完整的结构,而预苯酸脱氢酶结构域和调节结构域交织共存,结构松散。

大肠杆菌T蛋白的聚合状态分析

目的解析大肠杆菌T蛋白的四级结构。方法利用分段克隆法克隆表达了T蛋白及其两个独立结构域分支酸变位酶(CM,T/1-94)和预苯酸脱氢酶(PDH,T/93-373),再利用SDS-PAGE测得变性条件下T蛋白、CM和PDH的Mr分别为42×103,11×103和32×103,HPLC测得天然条件下CM和PDH的Mr分别为25×103和63×103,再用化学交联法分析聚合状态。结果显示T蛋白、独立结构域CM和PDH均为二聚体。结论说明大肠杆菌T蛋白二聚体是通过CM与CM、PDH与PDH相连的。

大肠杆菌T蛋白的聚合状态分析

目的 解析大肠杆菌T蛋白的四级结构。方法 利用分段克隆法克隆表达了T蛋白及其两个独立结构域分支酸变位酶（CM，T/1-94）和预苯酸脱氢酶（PDH，T／93-373），再利用SDS-PAGE测得变性条件下T蛋白、CM和PDH的M。分别为42×103，11×103和32×103，HPLC测得天然条件下CM和PDH的M。分别为25×103和63×103，再用化学交联法分析聚合状态。结果 T蛋白、独立结构域CM和PDH均为二聚体。结论 说明大肠杆菌T蛋白二聚体是通过CM与CM、PDH与PDH相连的。