分枝杆菌散在重复单位对结核分枝杆菌分型的研究

目的评价分枝杆菌散在重复单位(MIRU)分型方法在结核病流行病学上的应用,探讨该方法的应用前景。方法采用MIRU分型对158株结核分枝杆菌进行基因分型,这些菌株均已进行IS6110-RFLP分型。结果MIRU分型结果产生只需1d。158株结核分枝杆菌共产生105个类型,其中65个为独特类型。在MIRU的12个区中,重复区4、10、26、40具有较高的多态性。用Hunter-Gaston Index(HGI)对2种方法进行评价,IS6110-RFLP的分辨指数为99.4%,MIRU技术的分辨指数为97.8%。当IS6110拷贝数小于等于10个时,IS6110-RFLP的分辨指数为98%,MI-RU的分辨指数达到98.2%。结论MIRU分型方法具有快速、简便、分辨力较高的特点,便于普及,可在结核病分子流行病学研究中发挥重要作用。

基于常规引物靶向结核分枝杆菌Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位的恒温扩增

目的探讨基于特异常规引物(即引物不需折叠成特定二级结构)靶向恒温扩增重复DNA序列的方法,并测试其检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)的可能性。方法以合成的重复DNA或以抽提的细菌基因组DNA为模板,用Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶进行恒温扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果合成的重复DNA可用其特异常规引物进行恒温扩增。进一步,Mtb H37Rv Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位(mycobacterial interspersed repetitive units,MIRUs)可用其特异常规引物对(即Ⅱ_MIRU-F和Ⅱ_MIRU-R)或单引物(即Ⅱ_MIRU-F)进行恒温扩增。相比于非分枝杆菌菌株、非结核分枝杆菌菌株、Mtb复合物菌株和临床分离株,Ⅱ_MIRU-F能够高特异地扩增Mtb菌株。Ⅱ_MIRU-F针对Mtb H37Rv基因组DNA的检测下限较高,且不能特异地区分Mtb阴性痰液样本和Mtb阳性痰液样本。结论常规引物可恒温扩增重复DNA序列(包括MtbⅡ型MIRUs);MtbⅡ型MIRUs特异引物Ⅱ_MIRU-F不适合用于痰液样本的检测。

分枝杆菌散在重复单位对结核分枝杆菌分型的研究

目的评价分枝杆菌散在重复单位（MIRU）分型方法在结核病流行病学上的应用，探讨该方法的应用前景。方法采用MIRU分型对158株结核分枝杆菌进行基因分型，这些菌株均已进行IS6110－RFLP分型。结果MIRU分型结果产生只需1d。158株结核分枝杆菌共产生105个类型，其中65个为独特类型。在MIRU的12个区中，重复区4、10、26、40具有较高的多态性。用Hunter-Gaston Index（HGI）对2种方法进行评价，IS6110－RFLP的分辨指数为99．4％，MIRU技术的分辨指数为97．8％。当IS6110拷贝数小于等于10个时，IS6110－RFLP的分辨指数为98％，MIRU的分辨指数达到98．2％。结论MtRU分型方法具有快速、简便、分辨力较高的特点，便于普及，可在结核病分子流行病学研究中发挥重要作用。

吉林省鹿源牛分枝杆菌MIRU分型研究

为了解鹿源牛分枝杆菌(M.bovis)基因多态性,初步建立适合吉林省鹿源M.bovis的基因分型方法,本研究利用12个分枝杆菌散在重复单位(MIRU)位点,对96株鹿源M.bovis吉林分离株进行MIRU基因分型研究。结果显示,12个位点中有8个位点(MIRU2、4、16、23、27、31、39及40)具有多态性,可以将96株菌株分为11个基因型,分辨力指数(H)为0.893,其中6个中度多态性位点的分辨力为0.877。其余4个位点(MIRU10、20、24及26)未显示多态性。研究结果表明,鹿源M.bovis与其他宿主来源的M.bovis在基因分型上存在差异。MIRU位点对鹿源M.bovis具有良好的分辨力,该分型方法可以作为鹿结核病分子流行病学研究的有效方法。

结核分枝杆菌Mtub-39位点多态性与下游基因表达关系的研究

目的分析结核分枝杆菌(MTB)北京型菌株及非北京型菌株5个有明显差异的MTB散在分布重复单位(MIRU)位点,研究其多态性与下游基因表达的关系。方法利用生物信息学方法预测5个MIRU位点(ETR-C、Mtub-30、Mtub-39、MIRU-27、MIRU-40)下游相邻基因启动子区域。通过PCR方法扩增该区域并与分枝杆菌启动子探针载体pMC210连接,重组质粒测序正确后,用电穿孔方法转化耻垢分枝杆菌mc2155。采用Real-Time PCR技术检测报告基因lacZ的转录水平,验证MIRU位点多态性对其下游基因表达的影响。结果 Mtub-39位点核心区域内含有其下游基因的启动子。成功构建了分别带有1、3、5个拷贝重复序列的Mtub-39位点的重组质粒。Real-Time PCR结果显示,有多态性的Mtub-39位点(pMC210-Mtub-39-N158、pMC210-Mtub-39-N139及pMC210-Mtub-39-N146)对报告基因lacZ的转录调控差异有统计学意义(P=0.006 5)。结论 Mtub-39位点的多态性能明显影响下游基因启动子的活性进而调节其表达。

30株牛源分枝杆菌分离株基因分型鉴定

目的采用基因分型方法对30株分离自西北三省的牛源分枝杆菌分离株进行鉴定。方法从西北三省的规模化奶牛场采集结核菌素(PPD)阳性奶牛的咽拭子和鼻拭子,经分离培养后,采用16S rRNA、MPT64以及多位点PCR进行菌株分型鉴定,利用数目可变串联重复序列分析(variable-number of tandem repeats,VNTR)和分枝杆菌散在分布重复单元(Mycobacterial interspersed repetitive unit,MIRU)连用的方法对其基因型进行了分析。结果菌株分型鉴定结果表明,30株牛源临床分离株全部为分枝杆菌属,其中,12株属于结核分枝杆菌复合群,18株属于非结核分枝杆菌;12株结核分枝杆菌中10株为牛分枝杆菌,2株为人型结核分枝杆菌。MIRU-VNTR分析结果表明,12株结核分枝杆菌呈现10种VNTR基因型,4株聚集为2个基因簇。结论30株分离株均属于分枝杆菌属,且结核分枝杆菌中以牛分枝杆菌为主。

分枝杆菌散在分布重复单位分型法在分辨北京株结核分枝杆菌基因分型中的初步研究

随机按比例抽取武汉市结核病防治所2005年7—12月肺结核病患者的菌株，为评估分枝杆菌散在分布重复单位（MIRU）方法对北京家族株的分辨能力进行分型分析。

结核分枝杆菌散在重复单元分型技术在监狱结核病暴发中的应用

目的探讨结核分枝杆菌散在重复单元在监狱结核病暴发中的应用价值。方法应用结核分枝杆菌散在重复单位(MIRU)基因分型技术,对监狱结核病患者结核分枝杆菌分离株DNA进行基因型检测分析。结果7例监狱结核病患者结核分枝杆菌分离株中,6例结核分枝杆菌分离株MIRU基因型为233325153533,另一分离株MIRU基因型为242325152322;6例监狱结核病患者为同一传染源直接传播的结果,而另1例患者和其他6例患者非同一传染源传播。结论MIRU基因分型技术中结核病暴发时追踪传染源是可行的。

24位点可变串联重复序列和间隔区寡核苷酸分型对河南省结核分枝杆菌基因型的鉴定

目的了解河南省结核分枝杆菌的基因型别。方法采用经典24位点分枝杆菌散在重复单元-可变串联重复序列(mycobacterium interspersed repetitive unit -variable number of tandem repeat,MIRU-VNTR)和间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)对2015年间河南省不同地区的668株结核分枝杆菌进行基因分型。结果间隔区寡核苷酸分型将668株菌分为11个家族,35个基因型。在558株北京家族基因型中,典型北京家族菌株546株,非典型北京家族菌株12株。在110株非北京家族菌株中,8株为新发现菌株;另102株非北京家族菌株被分为10个家族,其中T家族有76株,包括T1家族59株,T2家族7株,T3家族10株。标准24位点VNTR将668株菌分为550个基因型,有508株菌显示出单一的基因型,另160株菌被分到42个不同的基因簇中。最大簇含有21株菌,其余簇包含2~20株菌。结论河南省结核分枝杆菌主要为北京家族基因型。

MIRU技术在石河子地区部分结核杆菌基因分型聚类分析中的初步应用

目的采用结核杆菌散在分布重复单位(mycobacterial interspersed repetitive units,MIRU)分型技术,对石河子地区结核杆菌临床分离株进行基因分型及聚类分析,初步筛选可用于石河子地区结核杆菌临床分离株基因分型的MIRU位点。方法以本实验室保存的结核杆菌临床分离株基因组DNA为模板,采用PCR技术与核酸凝胶电泳技术,分别对7个MIRU位点进行检测,计算分辨指数,应用ntsys2.10e软件对菌株基因型进行聚类分析。结果石河子市33株临床分离株有22种基因型,均与结核杆菌标准株(H37Rv)不同;在石河子地区结核杆菌临床分离株的7个MIRU位点中,分辨率高的位点有1个(MIRU26);中等有2个(MIRU10,MIRU16);低的有3个(MIRU23,MIRU39,MIRU40);有一个位点分辨率为0(MIRU27);石河子地区分离株总HGI指数为:0.966。结论本实验选取的7个MIRU位点中有3个(MIRU26,MIRU10和MIRU16)可用于石河子地区结核杆菌临床分离株初步基因分型。

某高级中学一起结核病聚集性疫情传播的时空序列与分子流行病学分析

目的探讨本起学校结核病聚集性疫情传播的原因、特点和规律,为持续改进学校结核病控制策略的有效实施提供科学依据。方法遵照广东省汕头市卫生健康局对本起疫情处置工作的具体要求,以指示病例为中心、以学习生活空间要素为重点、以人际交往活动要素为辅助进行密切接触者筛查,对纳入者进行结核病可疑症状检查、X线胸部检查和结核菌素(PPD)皮肤试验;对其中任何1项异常者进行IFN-γ释放试验、CT影像检查、痰涂片抗酸染色检查、分枝杆菌培养与菌种鉴定和Xpert MTB/RIF分子检测,以综合诊断结核病例;对分离培养获得的结核分枝杆菌,分析其ETRA、ETRB、ETRC、ETRE、ETRF、MIRU10、MIRU20、MIRU26、MIRU39、MIRU40、Mtub04、Mtub21、Mtub38、Oub11b、Qub26等15个基因位点的串联重复拷贝数,分析其成簇性以判断病例间的传播关系。结果(1)指示病例首次结核可疑症状出现并一直在校学习5个月后,出现双肺上叶斑片状、斑点状、条索状密度增高影和左肺上叶多发空洞(最大者约2.1 cm×1.7 cm)等病变,培养与分子检测阳性;(2)指示病例发现的3个月内,在该校相继发现其他15例学生肺结核患者,其中3例有临床症状、3例痰涂片镜检可疑阳性、9例培养阳性、7例分子检测阳性,10例与指示病例有同班上课、同舍住宿和同室晚自习等空间性密切接触,4例与指示病例有直接或间接的人际密切交往,1例则未找到明确的密切交往线索;(3)对9例患者分离培养的结核分枝杆菌进行基因分型,8例得到成功结果,15个VNTR-MIRU分型位点的拷贝数模式完全相同;(4)依据PPD皮肤试验≥5 mm判断结核感染,409例受检者中252例阳性,潜伏感染率为61.61%,潜伏感染率在指示病例班级与后续发现病例班级学生间差异有统计学意义(100%vs.56.58%,χ^(2)=30.781,P<0.001),而在男-女、学生-教职工、寄宿生-走读生、不同楼层学生、同层同侧-同层对侧学生等多组人群间则差异无统计学意义(P>0.05)。结论该起结核聚集性疫情为同一传染源传播所致,且导致了远高于一般人群的结核潜伏感染率,学校结核病控制管理缺失为其主要原因,强化学校结核病控制措施的有效执行力刻不容缓。

344株结核分枝杆菌的基因分型研究

目的研究间隔区寡核苷酸序列基因分型技术、结核分枝杆菌散在分布重复单位（MIRU）,以及多位点串联重复序列（VNTR）在河南省结核病分枝杆菌基因分型中的应用,了解河南省局部地区MIRU-VNTR基因型种类与分布,以及北京家族基因型在河南省的分布特征。方法应用2007年在河南省的嵩县、新密县、扶沟县、中牟县等4个县及南阳市的结核病防治机构实验室分离培养的344株结核分枝杆菌,设计引物,应用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术及间隔区寡核苷酸分型技术对结核分枝杆菌进行VNTR分型检测分析,基因分型聚类分析采用Bio-Numerics软件。结果对344株结核分枝杆菌临床分离株的间隔区寡核苷酸分型结果显示,有299株为北京家族基因型,占86.9%;12个MIRU位点检测结果显示明显的基因多态性;经基因聚类分析,可分5个基因群（Ⅰ~Ⅴ群）,292个基因型,Ⅰ~Ⅴ群分别占5.1%、67.8%、21.9%、1.4%、2.8%。结论河南省结核分枝杆菌MIRUs基因存在明显的多态性,存在≥5个MIRU型,主要流行型为Ⅱ型;北京家族基因型占主导地位,北京家族基因型与耐药无明显相关性。

2005—2006年奥地利难民中一次耐多药结核病的爆发

背景:2005—2006年奥地利结核病参比室验室确诊了4例菌株基因型相同的耐多药结核病患者。目的:明确耐多药结核菌传播途径。方法:通过查阅结核报告记录和医院出院单进行流行病学病例研究。结果:2004年6月,这个耐多药菌群中的原发病例(38岁),在因非法移民被扣留7个月后,最初被诊断为非耐多药结核病。到2005年3月,他有4个月失访。2005年6月他被诊断为肺和喉部的耐多药结核。出院后,这个病例又出现了失访,直到2006年4月,他因复发耐多药结核再次入院。2006年4月3例和原发病例有相同菌型的耐多药肺结核病例被确诊:原发病例5岁的女儿和25岁的朋友及朋友6个月的儿子。结论:由于奥地利耐多药结核病(MDR-TB)源于HIV阴性群体,显然有必要实施国家指南进行MDR-TB的管理。

黔北地区城、乡肺结核发病及分子流行病学特征差异比较

目的比较黔北地区城乡肺结核患者流行病学特征及结核分枝杆菌基因型特征的差异,分析农村结核高发的原因。方法对2011年12月-2013年6月期间黔北地区某医院及某疾病预防控制中心就诊肺结核患者的人口学资料及结核相关的行为生活方式特征进行调查,收集痰液标本并进行培养,培养阳性的进一步采用分枝杆菌散在重复单元(MI-RU)技术对结核分枝杆菌进行基因分型。结果农村患者初中以下文化程度、家庭年均人收入少于4 000元及肉类摄食每天不足一次者的构成比分别为56%、67. 18%、54. 96%,高于城市(镇)的26. 15%、50. 77%、40%(均P<0. 05);农村患者的结核分枝杆菌基因成簇率为19. 08%(25/131),高于城市(镇)的7. 69%(5/65)(P<0. 05),农村组基因簇群中具有流行病学关联的占48%,高于城镇组的0%。结论黔北地区贫穷及高近期传播仍然可能是农村肺结核高发的原因。