基于分枝菌酸的分枝杆菌反相高效液相色谱分型鉴定方法

采用反相高效液相色谱法(HPLC)构建了49种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹图谱库,并对分枝杆菌进行分型鉴定。菌株经培养(对于慢生长分枝杆菌培养3周,快生长分枝杆菌培养1周)后,取两植菌勺的量,皂化1h后,于4℃下储存。通过酸化方法提取分枝菌酸,并用4-溴苯甲酰基溴衍生化,以HPLC分析分枝杆菌衍生物,并以其峰形的分布及峰的相对保留时间、相对峰高为指标对分枝杆菌进行分型鉴定。该法重现性良好,各峰保留时间的相对标准偏差为0.13%～1.07%。根据构建的49种《伯杰细菌鉴定手册》中所载入的分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹谱库,发现不同菌种的分枝菌酸的指纹图谱分别具有单簇峰、双簇峰、三簇峰(含多簇峰)的特征。依据相对保留时间和相对峰高的不同,对49种分枝杆菌中的41种进行了分型。结果表明,所建立的反相HPLC法可快速准确地对分枝杆菌进行分型鉴定。

50种分枝杆菌标准株分枝菌酸指纹谱特征性研究

目的:构建50种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸(MA)指纹图谱库,并对该库指纹图谱进行比较研究。方法:选择50种标准分枝杆菌,经过接种、培养、皂化及酸化,提取到MA。MA衍生化后,采用高效液相色谱法(HPLC)进行分析,得到相应的指纹图谱。依据谱图的峰族数、相对保留时间及相对峰高详细分析与比对其特征性,并对所选92个临床分离株用本法进行鉴定。结果:通过对分枝杆菌MA的色谱分析,构建了50种分枝杆菌标准菌株的MA指纹谱库。图谱可分为3组,即单族峰型、两族峰型、三族峰型。每组分别包括10、23及17种。在92个临床分离株中,有89株的鉴定结果与已知结果一致,一致率为96.74%。结论:本研究所构建的指纹图谱全部具有特征性,对分枝杆菌的种间鉴定具有一定的参考价值。

基于分枝菌酸分析法鉴定分枝杆菌临床株

非结核分枝杆菌（NTM）病具有与结核病临床表现相似的全身中毒症状和局部损害,在无菌种鉴定的情况下,与结核病难以区别。NTM与TB对抗结核药物的敏感性大不相同,不同的NTM对药物的敏感性也不相同,根据不同菌种化疗方案应有所不同。

冠蛋白1参与分枝菌酸诱导巨噬细胞的泡沫化

目的研究巨噬细胞冠蛋白1(coronin-1)与分枝菌酸(MA)诱导巨噬细胞泡沫化的相关性及其可能机制。方法根据冠蛋白1表达水平的差异,实验分为RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7和RAW264.7-Cor.Minus三组。各组细胞经100μg/m L MA包被的聚苯乙烯微球作用24 h后提取总蛋白,用Western blot法检测细胞冠蛋白1的表达水平。分别用(0、25、50、75、100)μg/m L MA包被聚苯乙烯微球作为吞噬颗粒,在2μmol/L松胞菌素D(cty D)处理前、后,分别吞噬24 h^8 d,用总胆固醇(TC)酶法测定试剂盒、游离胆固醇(FC)酶法测定试剂盒分别检测各组细胞TC、FC,再通过胆固醇酯(CE)和CE/TC比值定量评估巨噬细胞泡沫化水平。将cty D处理细胞(RAW264.7-cty D、RAW264.7-cty D-MA)及其对照组分别用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(FITC-phalloidin)染色,计算纤维型肌动蛋白(F-actin)重排率。结果各组细胞受MA诱导后,其冠蛋白1的表达量显著高于相应对照组,其表达量从高至低依次为RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7、RAW264.7-Cor.Minus。表达不同水平冠蛋白1的各组细胞的泡沫化水平与MA包被剂量和MA作用时间呈正比;冠蛋白1表达量最高的RAW264.7-Cor.Plus细胞泡沫化水平最高,冠蛋白1表达量最低的RAW264.7-Cor.Minus细胞泡沫化水平最低;cty D抑制巨噬细胞F-actin显著降低MA诱导的细胞泡沫化水平,但抑制F-actin对冠蛋白1与MA诱导细胞泡沫化的正相关性并无显著影响;经鬼笔环肽染色后,MA诱导组细胞的F-actin重排率显著高于非MA诱导的对照组细胞。结论 MA可诱导巨噬细胞冠蛋白1的表达,其表达水平与MA诱导的细胞泡沫化呈正相关,F-actin参与MA诱导的细胞泡沫化过程,但F-actin并非冠蛋白1调控MA诱导细胞泡沫化的关键和唯一途径。

SMIS检测分枝菌酸在分枝杆菌菌种鉴定中的作用

目的评估用SMIS检测分枝菌酸在分枝杆菌菌种鉴定中的作用。方法收集北京市结核病胸部肿瘤研究所2007年1～12月的分枝杆菌118株，通过PNB培养基初筛，其中结核分枝杆菌复合群25株，非结核分枝杆菌93株。同时用测序方法和SMIS分析分枝菌酸方法鉴定118株分枝杆菌，以16SrDNA和16-23S rDNAITS测定作为菌种鉴定的标准，评估利用SMIS分离分枝菌酸鉴定分枝杆菌菌种的符合率及一致性；并验证以上两种方法鉴定结果分别与PNB初筛分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌结果的符合率及一致性。结果SMIS与测序鉴定分枝杆菌相比的符合率为92％（108／118），其中结核分枝杆菌复合群鉴定的符合率为95％（35／37），非结核分枝杆菌为90％（73／81），Kappa分析显示两种方法鉴定结果的一致性很好（Kappa=0．96）。回顾验证初筛结果显示，SMIS与PNB培养基方法鉴定结果符合率90％（106／118），一致性较好（Kappa=0．73）：测序方法与PNB培养基方法鉴定结果符合率也为90％（106／118），一致性较好（Kappa=0．74），但有11株测序和分枝菌酸菌种鉴定方法结果相同的结核分枝杆菌复合群与PNB实验结果不一致。结论利用分枝菌酸对临床分离的分枝杆菌进行菌种鉴定是一种快速、简便和准确的方法，对处置应急和突发公共卫生事件中的分枝杆菌菌种鉴定具有一定的参考价值，是分枝杆菌菌种多相鉴定策略的重要组成部分。

分枝菌酸诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定

目的探讨分枝菌酸(MA)包被聚苯乙烯微球诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞泡沫细胞化的条件及特性。方法将RAW264.7细胞分为空白对照组和分别包被(0、25、50、75、100)μg/mL MA的聚苯乙烯微球实验组,分别将细胞与聚苯乙烯微球混匀、共同孵育24、48、72 h、5 d和8 d后,油红O染色后显微镜下观察细胞形态,采用总胆固醇试剂盒和游离胆固醇试剂盒测定各组泡沫细胞内胆固醇酯的含量,采用MTT法检测细胞增殖水平。结果当包被MA浓度为75μg/mL、吞噬时间为24 h时,RAW264.7能形成典型的泡沫细胞,其细胞内胆固醇酯相对含量为60.98%±1.32%;随着吞噬时间延长,形成泡沫细胞所需的MA的浓度逐渐递减;且随着细胞泡沫化程度增加,细胞增殖活力逐渐减弱。结论 MA包被聚苯乙烯微球可快速诱导巨噬细胞形成泡沫细胞,MA浓度与细胞泡沫化程度呈正相关,且有时间依赖性。

分枝菌酸在分枝杆菌感染过程中的作用及相关抗结核药物靶点的研究进展

分枝菌酸作为高级支链脂肪酸,是维持分枝杆菌等微生物细胞壁骨架结构的重要物质,也是引起分枝杆菌感染宿主的主要化学因子,还在分枝杆菌的生物膜形成和体内免疫逃逸过程中发挥了重要作用。据此,科研人员以分枝菌酸合成中的关键酶为靶点,筛选和开发出了一系列有活性的抗结核化合物。该文综述了分枝菌酸在分枝杆菌感染过程中的作用和相关作用靶点的研究进展,为新型抗结核药物的开发提供参考。

一种改良的分枝菌酸提取及其非放射性TLC检测方法

分枝菌酸(mycolic acid,MA)是存在于分枝杆菌细胞壁中的独特长链脂肪酸,与分枝杆菌(mycobacterium)抵御不利环境、耐受抗生素和逃避宿主免疫密切相关,是较热门的抗结核药物筛选的靶点。MA的检测方法主要有放射性薄层层析(thin-layer chromatography,TLC)和液相色谱-质谱(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS),受放射性元素使用资质和标准品等的限制,MA分析是分枝杆菌相关研究的一个难点。本研究采用一种普通薄层层析技术,并对使用四丁基氢氧化铵溶液水解酯化的分枝菌酸,将其甲酯化后再用无水乙醚萃取分枝菌酸甲酯的操作步骤进行改良,使分枝杆菌的MA提取及分析可在常规生物实验室中开展。研究通过比较不同分枝杆菌及不同生长时期的MA成分与亚型特征、检测靶向分枝菌酸合成通路的抗结核药物对细菌MA合成影响以及分枝杆菌突变株对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)H37Ra分枝菌酸合成影响等基础和应用研究的3个方面,进一步验证该方法在分枝杆菌MA分析中的实用性。结果表明该方法在不使用放射性元素和缺少标准品情况下可简便快速地分析MA及亚型特征,可广泛用于新型抗分枝杆菌药物筛选靶向分枝菌酸合成通路机制及基础研究中MA相关的分析和应用。

SMIS检测分枝菌酸在分枝杆菌菌种鉴定中的作用

目的 评估用SMIS检测分枝菌酸在分枝杆菌菌种鉴定中的作用。方法 收集北京市结核病胸部肿瘤研究所2007年1—12月的分枝杆菌118株，通过PNB培养基初筛，其中结核分枝杆菌复合群25株，非结核分枝杆菌93株。同时用测序方法和SMIS分析分枝菌酸方法鉴定118株分枝杆菌，以16SrDNA和16—23SrDNAITS测定作为菌种鉴定的标准，评估利用SMIS分离分枝菌酸鉴定分枝杆菌菌种的符合率及一致性；并验证以上两种方法鉴定结果分别与PNB初筛分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌结果的符合率及一致性。结果 SMIS与测序鉴定分枝杆菌相比的符合率为92％（108／118），其中结核分枝杆菌复合群鉴定的符合率为95％（35／37），非结核分枝杆菌为90％（73／81），Kappa分析显示两种方法鉴定结果的一致性很好（Kappa=0．96）。回顾验证初筛结果显示，SMIS与PNB培养基方法鉴定结果符合率90％（106／118），一致性较好（Kappa=0．73）；测序方法与PNB培养基方法鉴定结果符合率也为90％（106／118），一致性较好（Kappa=0．74），但有11株测序和分枝菌酸菌种鉴定方法结果相同的结核分枝杆菌复合群与PNB实验结果不一致。结论 利用分枝菌酸对临床分离的分枝杆菌进行菌种鉴定是一种快速、简便和准确的方法，对处置应急和突发公共卫生事件中的分枝杆菌菌种鉴定具有一定的参考价值，是分枝杆菌菌种多相鉴定策略的重要组成部分。

18种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹谱比较

目的用本实验室所建立的高效液相色谱分枝菌酸分析方法,构建18种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹谱库,并对该库的分枝菌酸指纹谱进行比较。方法标准菌株按常规方法,分别转种到改良罗氏培养基斜面上培养,待菌落形成后,用化学法从培养物中提取细胞壁的分枝菌酸,经皂化、酸化和衍生后,制备出良好的分析样品,用于色谱检测分析。结果成功地构建了18种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹谱库,该指纹谱的重复性日内变异系数为0．20％-0．83％,均<1％。每种分枝菌酸的指纹谱都具有各自的特征,峰形也有一定规律。根据峰形的特点将其分为3类:A类(单组峰)包括结核、牛、戈登、爱知、堪萨斯、海分枝杆菌和卡介苗,B类(2组峰)包括蟾蜍、土地、新金色、不产色和浅黄分枝杆菌,C类(3组峰)包括胞内、鸟、金色、偶然、副偶然、脓肿和耻垢分枝杆菌。结论依据18种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹谱,即可对分枝杆菌菌种进行鉴定。卡介苗与牛分枝杆菌的分枝菌酸指纹谱的峰形存在很大差别,该现象很可能作为结核病潜伏感染和分枝杆菌耐药机制的一种新理论依据。

分枝菌酸诱导巨噬细胞泡沫细胞化对细胞自噬的影响

研究分枝菌酸(mycolic acid,MA)诱导的巨噬细胞泡沫细胞化对巨噬细胞自噬的影响,探讨MA促巨噬细胞泡沫细胞化的机制。构建LC3真核表达质粒(p EGFP-LC3B),转染RAW264.7细胞后获得其稳定转染细胞株(RAW264.7/p EGFP-LC3B);用MA诱导RAW264.7/p EGFP-LC3B获得RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞。实验分为三组:RAW264.7细胞组、RAW264.7/p EGFP-LC3B细胞组及MA诱导的RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组。通过RT-PCR法检测各组细胞中自噬相关基因Becn1、LC3B的转录水平,Western blot法检测各组细胞自噬标志蛋白LC3B II/I的表达水平。RTPCR检测结果显示,RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组的Becn1基因及LC3B基因的转录水平明显较其他两组低(P<0.05)。Western blot检测结果显示,RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组LC3B II/I比值明显较其他两组低(P<0.05)。由此可见,当巨噬细胞被MA诱导成为泡沫巨噬细胞后,其自噬功能显著降低。该研究证明,MA可能通过抑制巨噬细胞自噬,引起脂代谢失衡,进而发生巨噬细胞泡沫细胞化。

我国临床常见非结核分枝杆菌标准株分枝菌酸指纹谱比较

近年来，在世界范围内由于移民、HIV感染、耐药等因素，结核病和非结核分枝杆菌病的发病率均明显升高。分枝杆菌菌种鉴定不仅在流行病学上，而且在临床诊断和治疗上均有重要意义。

靶向分枝菌酸生物合成的抗结核化合物研究进展

结核病近年来已超过艾滋病成为当今世界范围内致死率高的感染性疾病之一.结核病耐药问题严峻,耐多药结核病治愈率低、治疗方案复杂且周期长.抗耐药结核领域存在重大研究机遇,亟需发现与发展针对新靶点的新化学实体.分枝菌酸的生物合成和转运途径富含抗结核药物的有效靶点,综述了靶向该途径的抑制剂,讨论了其作用机制、药代动力学性质等最新研究进展.

基于Ti^(4+)-IMAC富集的分枝菌酸小杆菌深度覆盖磷酸化蛋白质组研究

【目的】本研究以分枝菌酸小杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)为研究对象,探索适于原核微生物理想的磷酸化富集方法。【方法】我们比较了二氧化钛(TiO_(2))、Fe^(3+)-NTA和Ti^(4+)螯合在磷酸酯修饰的固相微球(Ti^(4+)-IMAC)3种不同富集方法磷酸化肽段的富集效率,并用不同分辨率的质谱仪评估富集稳定性。【结果】Ti^(4+)-IMAC富集效率最高,磷酸化位点数是TiO_(2)或Fe^(3+)-NTA方法的7倍以上;TiO_(2)和Fe^(3+)-NTA方法富集到的磷酸化位点数相差不大,与已报道的用TiO_(2)方法富集的磷酸化位点数目接近。Ti^(4+)-IMAC富集结果稳定性很好,高分辨率Lumos质谱仪鉴定到的磷酸化位点数是Velos的2.6倍。【结论】本研究较高效地实现了分枝菌酸小杆菌磷酸化事件的鉴定,共鉴定到2280个磷酸化蛋白、10880个磷酸化肽段及4433个可信磷酸化位点,有望用于其他微生物的磷酸化蛋白质组学研究。

反相高效液相色谱法和16S rRNA序列分析法对分枝杆菌分型鉴别的比较研究

目的比较反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和16S rRNA序列分析法对分枝杆菌分型鉴别的异同。方法将《伯杰细菌鉴定手册》中载入的49种分枝杆菌模式株接种于改良罗氏培养基上,置于最适温度下孵育。挑取生长良好且无污染的培养物,一部分经皂化和酸化提取分枝菌酸并衍生后,采用反相高效液相色谱法进行分枝菌酸指纹图谱构建;另一部分经裂解和PCR扩增,获得DNA,纯化后,采用核酸分析仪进行16S rRNA序列测定。结果 49种分枝杆菌模式株中,采用RP-HPLC分析时,单簇峰的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和胃分枝杆菌,双簇峰的爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌,三簇峰的南非分枝杆菌和母牛分枝杆菌共7种因各组内相对保留时间和相对峰高比值相近而难以进行鉴别;采用16S rRNA序列分析法分析时,产鼻疽分枝杆菌和塞内加尔分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、龟亚分枝杆菌和龟脓分枝杆菌以及结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌)共12种因各组内基因序列相似性百分比为100%而难以进行鉴别。通过两种分型鉴别方法的比较,可见除结核分枝杆菌和牛分枝杆菌外,两种分型方法相互补充,可将49种分枝杆菌模式株中的47种进行明确鉴别。结论分枝菌酸RP-HPLC和16S rRNA序列分析法均为分枝杆菌的分型鉴定提供了准确和有效的技术方法。两种方法相互借鉴能准确地将大多数分枝杆菌鉴定到种。

非结核分枝杆菌的菌种鉴定技术

随着菌种鉴定技术的进步,分枝杆菌菌种的数量不断增加。截至2015年底,已经被证实的分枝杆菌及其亚群数量已达到173种。不同种分枝杆菌感染疾病的症状和影像学表现十分相似,但治疗方案却大相径庭,因此,快速、准确地鉴定分枝杆菌至菌种水平是诊断和治疗各种分枝杆菌感染疾病的关键所在。