核盘菌分枝酸变位酶同源效应蛋白启动子的克隆及功能分析

为了进一步研究分枝酸变位酶同源效应蛋白在核盘菌与植物互作过程中的作用机制,对其启动子进行了克隆和功能分析。采用启动子在线软件Promoter 2. 0和Promoter scan分析分枝酸变位酶同源基因的上游序列,寻找其启动子位点和顺式作用元件,然后通过PCR技术克隆预测启动子的DNA序列,构建荧光蛋白GFP融合载体,转化核盘菌,最后通过检测GFP荧光信号来验证启动子功能。经生物信息学分析发现,该效应蛋白基因上游具有启动子序列特征,包含TATA盒和CAAT盒等顺式元件,采用引物XS1-1和XS1-2进行PCR扩增,得到了733 bp启动子序列,序列包含相关的启动元件,然后以质粒pBlunt NAT-GFP为基础,将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中,构建得到启动子N-Pro+GFP融合载体,通过REMI技术转化核盘菌原生质体,潮霉素筛选得到了一些转化子,PCR验证融合载体整合到了核盘菌基因组DNA上,最后经荧光显微镜检测到了菌丝GFP荧光信号,结果表明,克隆的分枝酸变位酶同源基因ATG上游733 bp的DNA序列具有启动子功能。

对氨基苯甲酸(PABA)的生物合成及酶功能的相互影响

由莽草酸经分枝酸进行的生物合成有五个反应途径 ,其中最复杂的是对氨基苯甲酸 (PABA)的合成 ,反应涉及到三个酶PabA、PabB和PabC。利用提纯的酶于实验里再现了生物体内的这一合成过程 ,在λ =2 65nm对酶的活性进行了连续的测定 ,经核磁共振确认了产物为PABA。在对底物作用中 ,PabB和PabC二聚体的形成对PABA的生物合成过程十分重要 ,它加速了PABA从PabB上的解离速度。当所加入的PabB和PabC的浓度比趋于 1:1时 ,PABA的生成速率趋于最大。

利福霉素B发酵放大 Ⅰ.从摇瓶到15L发酵罐的发酵放大

研究了溶氧和剪切力对地中海拟分枝酸菌 XC- 92 5发酵产生利福霉素 B的影响 ,并对利福霉素B从摇瓶到 15 L 发酵罐的发酵放大及 15 L 发酵罐流加补料发酵进行了研究。利用摇瓶研究结果表明地中海拟分枝酸菌 XC- 92 5发酵产生利福霉素 B时对溶氧要求较高 ,而对剪切力不太敏感。以溶氧为依据 ,在 15 L发酵罐间歇发酵过程中 ,控制溶氧不低于 2 5 % ,利福霉素 B的发酵效价可达到 10 0 0 0 u/ ml左右 ,发酵周期 (6 d)较摇瓶发酵缩短了 1d。 15 L 发酵罐如采用流加补料发酵工艺 ,利福霉素 B的发酵效价还会有较大幅度提高。

利福霉素B产生菌的推理选育

利福霉素 B由地中海拟分枝酸菌产生，本文对工业生产菌株A．mediterranei XC1-02进行进一步筛选。采用推理选育的方法使产生菌减轻由芳香族氨基酸[色氨酸（trp）、苯丙氨酸、酪氨酸]和对羟基苯甲酸（PHBA，Phb）引起的对利福霉素B生物合成的反馈抑制作用，并提高对前体丙酸（prp）的耐受量。通过UV诱变提高诱变株的耐受性，获得了高产菌株A． mediterranei XC 9-25（trpt，phbt prpt），其生产能力达到 1000u/ml，较原始出发菌株A．mediterranei XC 1－02提高了 1．385倍。动力学试验结果表明利福霉素B的生物合成与菌体生长不同步，属于非生长偶联型。

利福霉素B发酵放大Ⅱ.从15L发酵罐到7m^3发酵罐和60m^3发酵罐流加补料发酵放大

对利福霉素B从 15L发酵罐到 7m3 发酵罐和 60m3 发酵罐流加补料发酵放大进行研究。采用单位体积所消耗的通气功率相同的放大原则 ,成功地将 15L发酵罐流加补料发酵工艺放大到 7m3 发酵罐和 60m3发酵罐 ,发酵效价分别达到 172 49u/ml和 19110u/ml左右。 60m3 发酵罐利福霉素B发酵生产水平已达到国际先进水平。

利福霉素的生物合成及菌种选育

综述了利福霉素研究的进展 ,介绍了利福霉素的生物合成、遗传学研究 ,利福霉素生物合成的代谢调节、莽草酸途径的调节 ,利福霉素的发酵和生物转化以及利福霉素的菌种选育 .

分枝杆菌属菌种重新分类为5个属的进展

2018年2月,Gupta等[1]建议将分枝杆菌属(Mycobacterium)成员重新分类。分枝杆菌属最高水平中存在5个不同的单系分组(monophyletic groups),分别为Tuberculosis-Simiae(结核-猿猴,TS)、Terrae(土地,Te)、Triviale(次要,Tr)、Fortuitum-Vaccae(偶发-母牛,FV)、Abscessus-Chelonae(脓肿-龟,AC)。Gupta等由此建议分枝杆菌属(Mycobacterium)重新分类为5个属,并依次对科和5个属进行了描述。