分泌型肿瘤坏死因子相关激活诱导因子融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 表达及纯化人分泌型肿瘤坏死因子相关激活诱导因子 (secretedformTNF relatedactivation in ducedcytokine,sTRANCE)蛋白。方法 将sTRANCE结构基因重组到含麦芽糖结合蛋白 (MBP)的融合蛋白原核表达载体 pMAL c2x中 ,在大肠杆菌中进行表达。 结果 经IPTG诱导表达出的MBP sTRANCE融合蛋白相对分子质量约 70 0 0 0 ,并经Westernblot分析证实。用直链淀粉琼脂糖凝胶 (amyloseresin)亲和层析纯化得到电泳均一的融合蛋白。结论 成功地获得sTRANCE蛋白 ,为进一步研究其生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性打下了基础。

利用噬菌体环肽库筛选可溶性肿瘤坏死因子受体1的特异性结合肽

目的 应用噬菌体环肽库筛选肿瘤坏死因子α(TNF- α) 的模拟肽, 为研制模拟TNF -α的新型多肽药物奠定基础。方法 用亲和纯化的可溶性TNF受体1 (sTNFR -1) 作为筛选配基, 对噬菌体随机环肽库进行亲和筛选, 利用胞毒效应进行生物学筛选, 并进一步对某些阳性克隆进行序列测定和分析。结果 经3 轮筛选, 每轮的投入/产出比逐轮提高, 说明筛选具有良好的富集效果。并得到模拟跨膜型TNF -α(TM -TNF- α)、可溶型TNF -α(S- TNF -α) 的模拟肽和拮抗TNF作用的sTNFR 1 封闭肽。获得了TM -TNF -α的模拟肽的氨基酸序列的基序。结论 获得的模拟TM -TNF- α生物学效应的sTNFR -1结合肽, 可望发展成为一种新的TNF- α肽类新药。

LPS刺激对寻常型银屑病患者单核细胞合成和分泌TNF-α的影响

探讨寻常型银屑病(PV)患者外周血单核细胞(MC)合成和分泌的分泌型TNF-α(sTNF-α)、膜相关型TNF-α(MA-TNF-α)和膜TNF-α在PV发病机制中的作用。收集和培养PV患者MC,经LPS刺激后检测其合成和分泌各型TNF-α的生物学活性。结果PV患者MC合成和分泌的sTNF-α、总TNF-α(包括膜TNF-α和MA-TNF-α)、MA-TNF-α和膜TNF-α的生物学活性均显著高于正常对照组(均P<0.01)。MC合成和分泌的sTNF-α、MA-TNF-α和膜TNF-α在PV发病中均发挥重要作用。

重组分泌型可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体腺病毒诱导脑胶质瘤U251细胞凋亡的特点

胶质瘤的基因治疗是目前肿瘤研究的热点。我们在前期研究的基础上，将构建的携带可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（sTRAIL）的重组腺病毒（Ad—sTRAIL）作用于人脑胶质瘤U251细胞，观察瘤细胞的凋亡特点，探讨细胞凋亡与细胞周期的相关性。

两型TNF-α对HL-60细胞毒效应及其机制研究

目的前期研究表明，膜型TNF-α较分泌型TNF-α具有更强和更广的细胞毒作用，本研究拟进一步研究两型TNF-α介导胞毒效应的差异。方法采用对两型TNF-α反应性不同的HL-60为靶细胞；MTT法检测两型TNF-α对HL-60的胞毒活性；RT-SSCP法检测p53基因；通过检测荧光素酶报告基因表达水平，反映NF-kB活性的变化。结果TM-TNF可以有效杀伤HL-60，S-TNF则不能。S-TNF诱导HL-60的NF-kB活性升高，TM-TNF则不能诱导HL-60的NF-kB活性升高。同时我们发现HL-60细胞的p53基因是突变的。结论HL-60细胞对S-TNF胞毒作用耐受，对TM-TNF敏感；此种差异可能在于TM—TNF能够有效抑制NF-kB的激活，进而下调突变p53基因，最终导致其抗凋亡效应减弱，杀伤效应增强，其具体机制有待深入研究。

两型TNF-α及其受体在胸主动脉缩窄诱导压力负荷心肌肥厚小鼠中的表达

目的检测压力负荷所致心肌肥厚小鼠模型心肌组织中两型TNF及其受体的表达。方法使用野生型BALB/c小鼠,将其分为假手术组(n=10只)和手术组(n=8只),通过胸主动脉缩窄术诱导压力负荷性心肌肥厚模型。术后2周处死小鼠,并对小鼠进行心脏形态学、血流动力学检测;使用Western Blot方法对心肌组织中两型TNF-α及其受体表达进行检测。结果(1)在BALB/c小鼠中成功建立胸主动脉缩窄诱导心肌肥厚模型;(2)术后2周手术组小鼠心脏组织中可见分泌型TNF-α和跨膜型TNF-α表达量均有增加,且分泌型TNF-α表达量明显高于跨膜型TNF-α,差异有统计学意义(P<0.05);(3)术后2周小鼠心脏组织中TNFR1和TNFR2表达量均有增加,但TNFR1表达量高于TNFR2(P<0.05)。结论在小鼠压力负荷诱导心肌肥厚模型中,两型TNF-α及其两种受体表达量均有增加。虽然起负性肌力作用的分泌型TNF-α及TNFR1表达起主导作用,其研究相对集中且广泛,但跨膜型TNF-α和TNFR2表达量增加提示其在这一病理过程中具有生物学作用。其作用和机制仍需进一步研究。

pEgr1-hsTRAIL质粒对肺腺癌A549细胞放射敏感性及DR4和DR5表达水平的影响

目的:检测转染pEgr1-hsTRAIL质粒的人肺腺癌A549细胞放射敏感性变化及其对死亡受体(DR)4和DR 5mRNA和蛋白表达的影响,探讨pEgr1-hsTRAIL质粒的辐射增敏效应和诱导细胞凋亡的可能机制。方法:实验分为正常对照(Normal control)组、pEgr1-hsTRAIL组、6Gy X线照射组和pEgr1-hsTRAIL+6GyX线照射组。A549细胞经过阳离子脂质体转染、X线深部治疗机照射后,利用平板克隆形成试验检测细胞放射敏感性,反转录RCR(RT-PCR)法检测DR4和DR5mRNA表达变化,Western blotting法检测DR4和DR5蛋白表达的变化。结果:正常对照组和pEgr1-hsTRAIL组A549细胞的平均致死剂量(D0值)分别为3.26和1.91Gy,说明pEgr1-hsTRAIL质粒能够增强A549细胞的放射敏感性。RT-PCR显示,转染pEgr1-hsTRAIL质粒对DR4和DR5mRNA和蛋白表达水平无明显影响,而6Gy X线照射后DR4和DR5mRNA表达均显著高于正常对照组(P<0.05),转染pEgr1-hsTRAIL质粒后再进行6Gy X线照射,DR4和DR5mRNA表达水平均显著高于正常对照组(P<0.05),但只有DR5mRNA表达水平显著高于6Gy X线照射组(P<0.05)。Westernblotting结果显示,与正常对照组比较,DR4和DR5蛋白在pEgr1-hsTRAIL组无明显变化,而在6Gy X线照射和pEgr1-hsTRAIL+6Gy X线照射组表达增加,其中DR5蛋白在pEgr1-hsTRAIL+6Gy X线照射组增加更明显。结论:重组表达质粒pEgr1-shTRAIL能够增强A549细胞放射敏感性,且能增强DR5辐射诱导表达,而对DR4的辐射诱导表达无明显增强作用。

辐射诱导的重组载体pEgr1-hsTRAIL对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用

目的:构建Egr1介导的人分泌型肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(hsTRAIL)重组表达载体pEgr1-hsTRAIL,探讨其对人肺腺癌A549细胞的生长抑制作用。方法:利用基因重组技术构建Egr1介导的hsTRAIL重组载体,PCR、酶切和测序鉴定正确后转染A549细胞,给予6Gy X射线照射。实验分为对照(Control),pEgr1-hsTRAIL、6Gy X射线和pEgr1-hsTRAIL+6Gy X射线组。ELISA法检测各组A549细胞中hsTRAIL的表达,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,TUNEL法检测细胞凋亡变化。结果:成功构建Egr1调控的hsTRAIL重组载体pEgr1-hsTRAIL,质粒转染后经6Gy X射线照射,对照组、6Gy组和pEgr1-hsTRAIL组hsTRAIL蛋白表达随时间延长变化不明显,而pEgr1-hsTRAIL+6Gy组随时间延长hsTRAIL蛋白表达显著增加(P<0.05或P<0.01),8h达到峰值;pEgr1-hsTRAIL组A549细胞增殖能力与对照组比较无明显差异,6 Gy和pEgr1-hsTRAIL+6 Gy组A549细胞增殖能力较对照组显著降低,pEgr1-hsTRAIL+6Gy组降低更明显(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,pEgr1-hsTRAIL组A549细胞各期百分比变化不明显,而6Gy和pEgr1-hsTRAIL+6Gy组G0/G1期细胞百分比明显增加(P<0.05),G2/M期细胞百分比明显降低(P<0.05),S期细胞百分比无明显变化;各期细胞百分比在6Gy和pEgr1-hsTRAIL+6Gy组基本一致;与对照组比较,pEgr1-hsTRAIL组A549细胞凋亡百分比无明显变化,而6Gy和pEgr1-hsTRAIL+6Gy组A549细胞凋亡百分比明显增加(P<0.01),其中pEgr1-hsTRAIL+6Gy组增加更明显。结论:成功构建Egr1介导的hsTRAIL重组表达载体pEgr1-hsTRAIL,其能够增加辐射对A549细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,而对细胞周期分布影响不大。

TNFR1及其突变体重组质粒的构建及肿瘤生物学功能的研究

[目的]构建TNFR1及其突变体重组质粒,研究TNFR1胞浆段结构域与sTNF-α肿瘤生物学功能的关系。[方法]通过RT-PCR和重叠PCR,构建TNFR1-pEGFP-N1,Y236A-TNFR1-pEGFP-N1、ΔNSD-TNFR1-pEGFP-N1和ΔDD-TNFR1-pEGFP-N1。采用荧光显微镜观察TNFR1内吞、流式细胞术检测表达率、MTT比色法检测胞毒。[结果]获得了TNFR1全长基因及相关突变体的重组质粒,无任何其他点突变,移码及缺失突变。以这些质粒为工具进行生物学检测,提示野生型TNFR1可以介导sTNF-α内化,Y236A-TNFR1却不能,ΔNSD-TNFR1和ΔDD-TNFR1同样影响sTNF-α对靶细胞的胞毒作用。[结论]TNFR1内化结构域、NSD和DD功能域对sTNF-α杀伤肿瘤细胞的功能起着重要的作用。该研究有助于进一步认识sTNF-α介导的杀瘤效应与TNFR1的关系,并为深入研究tmTNF-α通过TNFR1介导的杀瘤机制提供重要的实验工具,从而为肿瘤基因治疗提供新的靶点。