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人纤溶酶原饼环区5(hPK5)基因的分泌型表达 被引量:5
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作者 牛勃 陈显久 +4 位作者 张东昌 解军 张悦红 杨琦 程牛亮 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2003年第9期91-95,共5页
构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )基因的原核可溶性表达载体并进行表达和纯化 ,获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白。以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增了hPK 5基因 ,经过适当酶切后构建表达载体pET2 2b( + ) hPK 5 ,转入大肠杆菌BL... 构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )基因的原核可溶性表达载体并进行表达和纯化 ,获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白。以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增了hPK 5基因 ,经过适当酶切后构建表达载体pET2 2b( + ) hPK 5 ,转入大肠杆菌BL2 1 (DE3)进行表达并经组氨酸亲和层析获得纯化。带有重组质粒pET2 2b( + ) hPK 5的大肠杆菌经IPTG诱导后以可溶性形式表达 1 6kDa的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白的 30 %以上 ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有His tag抗原活性。构建了pET2 2b( + ) hPK 5重组质粒并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量hPK 5基因工程产品奠定了实验基础。 展开更多
关键词 人纤溶酶原饼环区5 分泌型表达 基因克隆 原核表达 肿瘤 药物
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小鼠核因子κB受体活化因子配基(RANKL)活性区cDNA在毕赤酵母中分泌型表达 被引量:4
2
作者 王宝利 郭刚 +3 位作者 梁东春 赵学勤 张镜宇 邱明才 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期451-456,共6页
由小鼠骨组织提取总RNA ,采用RT PCR扩增得到小鼠核因子κB受体活化因子配基(RANKL)活性区域cDNA .将该cDNA片段克隆入表达载体pPIC9,重组载体转化巴斯德毕赤酵母GS115细胞 ,筛选Mut+表型 ,经甲醇诱导实现目的基因的分泌型表达 .Tricine... 由小鼠骨组织提取总RNA ,采用RT PCR扩增得到小鼠核因子κB受体活化因子配基(RANKL)活性区域cDNA .将该cDNA片段克隆入表达载体pPIC9,重组载体转化巴斯德毕赤酵母GS115细胞 ,筛选Mut+表型 ,经甲醇诱导实现目的基因的分泌型表达 .Tricine SDS PAGE显示 ,表达产物约 2 6kD ,经Western印迹鉴定 ,表达产物可被RANKL抗体识别 .采用硫酸铵盐析、CM SephadexC 2 5层析纯化重组蛋白 .经测定 ,发酵液上清重组蛋白表达量约 11mg L .采用破骨细胞样细胞(osteoclastlikecell,OLC)诱导分化实验检测重组蛋白的生物活性 ,证实该重组蛋白可以促进OLC的生成 。 展开更多
关键词 小鼠 核因子kB受体活化因子配基 活性区 CDNA 毕赤酵母 分泌型表达
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毕赤氏酵母SMD1168/HuIFNα-2b分泌型表达的研究 被引量:5
3
作者 周鹏 郭安平 +2 位作者 沈文涛 黎小瑛 梁国栋 《药物生物技术》 CAS CSCD 2003年第5期287-291,共5页
利用毕赤氏酵母SMD1168构建huIFNα 2b分泌型高效表达工程菌株 ,以提高huIFNα 2b表达量和生物比活性 ,增强临床治疗效果和降低临床应用的毒性副作用。将克隆修饰的huIFNα 2b基因插入pGAPZα A之GAP启动子下游位点 ,构建成含α factor... 利用毕赤氏酵母SMD1168构建huIFNα 2b分泌型高效表达工程菌株 ,以提高huIFNα 2b表达量和生物比活性 ,增强临床治疗效果和降低临床应用的毒性副作用。将克隆修饰的huIFNα 2b基因插入pGAPZα A之GAP启动子下游位点 ,构建成含α factor信号肽的重组表达载体 ,转入毕赤氏酵母 (Pichiapastoris)SMD1168,构建成分泌型表达huIFNα 2b的酵母工程菌株。SDS PAGE分析表明 ,该工程菌株huIFNα 2b表达量占菌体分泌总量的 50 %以上 ,表达量为 10 0~ 12 0 μg ml;MTT法测定纯化样品的生物比活性为 6 69× 10 8IU mg蛋白~ 1 11× 10 9IU mg蛋白 ,并通过柱层析分离纯化了huIFNα 2b ,纯度达 99 7% ,回收率达 15%~ 2 0 % ;Westernblotting分析表明表达的huIFNα 2b具有与天然huIFNα 展开更多
关键词 毕赤氏酵母 SMD1168 Α-2B干扰素 分泌型表达 毒性 副作用 临床治疗
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戊型肝炎病毒结构区OFR2基因在毕赤酵母中的分泌型表达 被引量:3
4
作者 张春江 沈心亮 +1 位作者 雷清 李启民 《药物生物技术》 CAS CSCD 2002年第4期200-204,共5页
为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲醇营养型酵母Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2 1.3 kb基因。对构建的酵母分泌型表达载体pHIL-S1/HEV和pPIC9/HEV重组体,酶切线性化后转化入GS115酵母菌... 为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲醇营养型酵母Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2 1.3 kb基因。对构建的酵母分泌型表达载体pHIL-S1/HEV和pPIC9/HEV重组体,酶切线性化后转化入GS115酵母菌,经表型鉴定,PCR扩增筛选阳性克隆,对不同表型,不同表达载体的重组株用含甲醇的培养基诱导表达,ELISA及SDS-PAGE筛选表达活性菌株,Western-blot证实表达蛋白与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株并初步优化表达条件。 展开更多
关键词 肝炎病毒 结构区 OFR2基因 毕赤酵母 分泌型表达
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微紫青霉CBHⅠ酶纤维素结合结构域在大肠杆菌中的分泌型表达及性质研究 被引量:7
5
作者 汪天虹 邹玉霞 +3 位作者 石屹峰 高培基 刘佶 吴静 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 2000年第5期644-649,共6页
为研究纤维素酶纤维素结合结构域的结构与功能 ,进而深入了解天然纤维素的生物降解机制和提高纤维素酶的生物工艺学价值 ,采用 PCR技术体外扩增了携带微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶 ( CBH ) CBD编码区的 DNA片段 ,将 CBD编码区 DN... 为研究纤维素酶纤维素结合结构域的结构与功能 ,进而深入了解天然纤维素的生物降解机制和提高纤维素酶的生物工艺学价值 ,采用 PCR技术体外扩增了携带微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶 ( CBH ) CBD编码区的 DNA片段 ,将 CBD编码区 DNA片段插入带有 Erwiniacarotovora pe1 B前导肽序列的大肠杆菌质粒 p KK- tac- new上进行了表达 .携带微紫青霉 CBDCBH 编码区的大肠杆菌重组菌株 DH5α( p KK- tac- new- 8)产生有活性的分泌型 CBDCBH 蛋白 .SDS-PAGE检测显示所产生的 CBDCBH 蛋白分子量约 1 0 .8k D.在 IPTG诱导下 ,该菌株所产生的CBDCBH 蛋白含量达 45.2 mg/L,且 90 %以上的 CBD蛋白分泌到培养物上清液中 .结晶纤维素 CF-1 1溶液经 CBDCBH 处理后 ,浊度比对照提高了 1 2 8.9% ,天然棉花纤维结构经 CBDCBH 处理后产生一定程度的非水解性降解作用 ,表明微紫青霉 CBDCBH 具有解聚天然结晶纤维素的作用 . 展开更多
关键词 微紫青霉 CHBⅠ 纤维素结合结构域 分泌型表达
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人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建 被引量:3
6
作者 杨湘越 兰小鹏 +4 位作者 冯福英 吴文冰 钟智强 廖剑 朱忠勇 《实用医学杂志》 CAS 2006年第22期2575-2577,共3页
目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提... 目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确。结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础。 展开更多
关键词 干燥综合征 毕赤酵母 分泌型表达载体
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hsBLyS分泌型表达载体构建及CHO表达 被引量:1
7
作者 吴海涛 胡云龙 +3 位作者 刁振宇 金丽娜 李洁 张双全 《南京师大学报(自然科学版)》 CAS CSCD 2004年第2期81-86,共6页
本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突... 本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突变同义密码 ,最终重组质粒成为分泌表达质粒 ;磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV dhfr,共转染CHO—dhfr- 细胞 ;选择培养液筛选 ,氨甲喋呤扩增表达 ,获稳定表达rhsBLyS细胞株 ;ELISA检测浓缩表达上清 ,结果表明 :rhsBLyS表达量由 0 13 μg/mL上升至 0 5 5 μg/mL . 展开更多
关键词 HSBLYS CHO 基因表达 信号肽 分泌型表达载体 免疫调节因子
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Annexin32酵母分泌型表达载体的构建及其高拷贝转化子的快速筛选 被引量:1
8
作者 杨湘越 武圣明 +1 位作者 陈蕊雯 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期695-696,共2页
关键词 Annexin32 酵母分泌型表达载体 构建 高拷贝转化子 快速筛选 毕赤酵母 G418抗性筛选
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新型酵母表达系统-Pichia.pastoris高效分泌型表达病毒生长因子的研究 被引量:2
9
作者 付平平 黎洋 《中国免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2000年第7期378-380,共3页
目的:实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法:构建pPIC9K/VGF表达载体,扩增引物分别为P1:TATACGTAGATAGTGGTAAGG,P2:TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT;采用Pichia.pastoris酵母表达系统。结果:经酶切鉴定,证明克隆的基因是正确... 目的:实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法:构建pPIC9K/VGF表达载体,扩增引物分别为P1:TATACGTAGATAGTGGTAAGG,P2:TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT;采用Pichia.pastoris酵母表达系统。结果:经酶切鉴定,证明克隆的基因是正确的;经SDS-PAGE分析,证明转化基因组中确实整合有VGF基因,其分子量为9.6kD;得到了高效分泌型VGF高产菌株,目的蛋白占培养液上清蛋白总量的80%以上,产量为0.45g/L。结论:证实可以通过Pichia.pasoris系统制备可溶性痘菌病毒生长因子。为大规模工业生产打下基础。 展开更多
关键词 痘苗病毒生长因子 酵母表达系统 分泌型表达
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应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体 被引量:1
10
作者 黄仪秀 陈杰鹏 +3 位作者 毕群 李斯明 张磊 朱圣庚 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第6期642-645,共4页
应用PCR重组技术,对大肠杆菌分泌型表达载体pIN-ⅢompA进行改建,除去原载体的HindⅢ位点,将信号肽序列末端两个密码子CAGGCC改为CAAGCT,从而引入一个新的HindⅢ位点,并在其下游接上一段多克隆位点... 应用PCR重组技术,对大肠杆菌分泌型表达载体pIN-ⅢompA进行改建,除去原载体的HindⅢ位点,将信号肽序列末端两个密码子CAGGCC改为CAAGCT,从而引入一个新的HindⅢ位点,并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源DNA编码序列,表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质,操作十分简便。 展开更多
关键词 大肠杆菌 分泌型表达载体 聚合酶链反应
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腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊IL-2融合基因的分泌型表达
11
作者 刘艳环 苗利光 +2 位作者 王克坚 刘波 李理 《动物医学进展》 CSCD 2004年第2期69-70,共2页
用改进的 Mg Cl2 法制备宿主菌株PAK/ 2 pfs感受态细胞 ;由 JM10 5工程菌中提取纤毛蛋白与绵羊白细胞介素 2 ( Pilin-IL-2 )融合基因表达载体 ,转化宿主细胞 PAK/ 2 pfs,筛选出具有 Pilin-IL-2融合基因表达载体的阳性克隆菌株 ;在营养... 用改进的 Mg Cl2 法制备宿主菌株PAK/ 2 pfs感受态细胞 ;由 JM10 5工程菌中提取纤毛蛋白与绵羊白细胞介素 2 ( Pilin-IL-2 )融合基因表达载体 ,转化宿主细胞 PAK/ 2 pfs,筛选出具有 Pilin-IL-2融合基因表达载体的阳性克隆菌株 ;在营养肉汤中进行 Pilin-IL-2融合基因的表达。培养 16~ 18h后 ,离心 ,向上清液中加入饱和 ( NH4) 2 SO4提取 Pilin-IL-2融合基因表达蛋白。用羊抗兔 E型节瘤拟杆菌抗血清与提取的融合蛋白进行对流免疫电泳 。 展开更多
关键词 腐蹄病 节瘤拟杆菌 纤毛蛋白 绵羊 融合基因工程疫苗 分泌型表达 白细胞介素2 免疫佐剂
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单链抗体在大肠杆菌中的分泌型表达
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作者 刘德新 李小鹰 王琰 《军医进修学院学报》 CAS 2002年第3期233-235,共3页
单链抗体 (scFv)是目前报道最多的一类小分子抗体 ,对科研及疾病的诊断和治疗有重要意义。本文介绍了scFv在大肠杆菌周质腔及培养基中分泌型表达的特点。
关键词 单链抗体 大肠杆菌 分泌型表达 免疫球蛋白类
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昆虫抗真菌肽基因的分泌型表达及活性鉴定 被引量:2
13
作者 桑延霞 邓小娟 +4 位作者 杨婉莹 刘文权 王文献 黄亚东 曹阳 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期842-849,共8页
【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin(Drs)及其同系物Drosomycin-like C(Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效... 【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin(Drs)及其同系物Drosomycin-like C(Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效分泌型表达,对探讨利用转基因酵母的发酵液直接进行果蔬、食品和农产品防腐保鲜的生物技术研发有重要意义。【方法】将Drosomycin基因(Drs)及其同系物基因Drs-lC和Thanatin基因分别与酵母分泌型表达载体pPICZαA重组,构建成重组表达质粒pPICZαA-Drs、pPICZαA-Drs-lC和pPICZαA Thanatin。利用电转化将重组质粒转化毕赤酵母GS115,经表型筛选和PCR鉴定获得的重组毕赤酵母转化子,在甲醇诱导下进行抗真菌肽的分泌表达。【结果】3种抗真菌肽基因的酵母表达产物对6个供试真菌中的5个有明显的抑制作用,Thanatin同时对供试细菌有抗菌活性。【结论】Drs、Drs-lC和Thanatin抗真菌肽基因成功地转化毕赤酵母,并实现其分泌型表达。 展开更多
关键词 昆虫 抗真菌肽 毕赤酵母 分泌型表达 抗真菌活性鉴定
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可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体 被引量:2
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作者 张超 刘刚 +1 位作者 余少文 邢苗 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期52-58,共7页
从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点... 从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaI酶切位点。通过XhoI和XbaI位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105I酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因(cbh2)的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余氨基酸。 展开更多
关键词 纤维二糖水解酶 巴氏毕赤酵母 分泌型表达载体 里氏木霉 T-载体
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猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达 被引量:3
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作者 徐彦召 张彦明 +4 位作者 何雷 唐青海 代晨 王静 杨小云 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2009年第5期7-11,共5页
【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pS... 【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。 展开更多
关键词 猪瘟病毒囊膜蛋白 猪脐静脉血管内皮细胞 分泌真核表达载体 真核表达
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“重组前列腺分泌蛋白PSP94的分泌型表达”项目通过鉴定
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《医药化工》 2005年第3期46-46,共1页
目前,由吉林大学基础医学院承担的吉林省科技发展计划国际合作项目“重组前列腺分泌蛋白PSP94的分泌型表达”通过该省科技厅组织的鉴定。该项研究着眼于解决前列腺癌诊断中PSA早期筛查的“灰色区”问题,开发一种有应用价值的抗前列腺... 目前,由吉林大学基础医学院承担的吉林省科技发展计划国际合作项目“重组前列腺分泌蛋白PSP94的分泌型表达”通过该省科技厅组织的鉴定。该项研究着眼于解决前列腺癌诊断中PSA早期筛查的“灰色区”问题,开发一种有应用价值的抗前列腺癌的生物制剂。利用大肠杆菌的分泌型表达技术,重组得到具有天然结构的人前列腺分泌蛋白PSP94, 展开更多
关键词 生物制剂 大肠杆菌 分泌型表达技术 PSP94 前列腺癌
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人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选
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作者 王广兰 宫璀璀 +3 位作者 刘亚利 初霞 王文丽 李璇 《实用医药杂志》 2009年第11期61-63,66,共4页
目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1... 目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。 展开更多
关键词 可溶性1补体受体1 毕赤酵母细胞 G418抗性筛选 分泌型表达载体
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人促甲状腺激素受体A亚单位蛋白在昆虫细胞体系中的分泌性表达
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作者 张萌 张恺宁 +5 位作者 陈子怡 王玲 伍丽萍 王悦 刘冰 施秉银 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期409-414,共6页
目的拟构建昆虫细胞分泌表达体系,在草地夜蛾卵巢细胞分泌性促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)A亚单位蛋白。方法将TSHR A亚单位蛋白(22-289)和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因连接到质粒... 目的拟构建昆虫细胞分泌表达体系,在草地夜蛾卵巢细胞分泌性促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)A亚单位蛋白。方法将TSHR A亚单位蛋白(22-289)和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因连接到质粒,并通过转化、蓝白斑筛选获得重组杆粒,将其转染入sf9昆虫细胞收获重组杆状病毒,扩增并测定滴度。最终通过蛋白印迹实验鉴定重组蛋白的表达并优化表达条件。结果在蛋白表达体系的构建过程中,PCR鉴定和测序均证实了重组质粒和重组杆粒序列的正确性。将重组杆粒转染入细胞后观察到病毒出芽迹象,空斑实验鉴定P1代病毒的滴度为2×10^(7) pfu/m。蛋白印迹显示重组蛋白分子质量为55 ku,主要在培养基中。蛋白表达的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1,最佳感染时程为72 h。结论本研究构建了TSHR A亚单位的昆虫细胞杆状病毒表达体系,该体系能够外泌性表达分子质量为55 ku左右的蛋白TSHR 22-289,且蛋白能够成功的糖基化修饰。该系统为其工业化平台的建设及生产提供前期基础,也针对日后TSHR蛋白的研究和Graves病的病因预防提供了有用的工具。 展开更多
关键词 人促甲状腺激素受体A亚单位 昆虫细胞体系 分泌型表达 SF9细胞 GRAVES病
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微紫青霉CBHI酶CBD编码区的分泌型表达及性质的初步研究
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作者 汪天虹 邹玉霞 高培基 《云南大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 1999年第S3期357-358,共2页
关键词 微紫青霉 外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ 纤维素吸附区 分泌型表达 PCR 疏解作用
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一种新型广谱的原核型分泌表达载体的建立及人表皮生长因子的表达 被引量:1
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作者 郝春芳 徐虹 +1 位作者 章军 刘仁海 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1192-1197,共6页
通过Cyanobase藻类学数据库查询,从集胞藻6803转译后加工过程中的某些蛋白的分泌信号序列得到了可以用于分泌型表达的信号序列,进一步通过SignalP3.0Server分析软件预验证,从集胞藻6803得到4种不同蛋白的信号序列A、B、C、D,将这些信号... 通过Cyanobase藻类学数据库查询,从集胞藻6803转译后加工过程中的某些蛋白的分泌信号序列得到了可以用于分泌型表达的信号序列,进一步通过SignalP3.0Server分析软件预验证,从集胞藻6803得到4种不同蛋白的信号序列A、B、C、D,将这些信号序列插入pET-His-EGF表达载体hegf基因上游,得到了带有分泌型信号的pS-X系列分泌型表达载体,人表皮生长因子(hEGF)在其中的pS-A载体中实现了分泌型表达,hEGF分泌到周质空间的相对表达量约为1%,在其它3个载体中未见表达。获得的pS-A分泌型表达载体是一种新型分泌型表达载体,它利用蓝藻信号序列作为分泌表达的信号肽,实现了hEGF多肽在大肠杆菌中分泌表达,通过融合白亚细胞定位法处理得到的hEGF多肽在胞质、周质空间和培养基中表达的比例为85∶33∶25(density intensity/mm^2),利用渗透休克处理方法得到的比例为50∶37∶25。由于A信号序列本身是集胞藻6803膜蛋白(ID:s110172/NCBI-GI:1001433)的分泌信号肽,说明pS-A载体是一种广谱的原核型分泌表达载体。这一结果为实现hEGF在螺旋藻中的分泌型表达奠定了基础。 展开更多
关键词 人表皮生长因子(hEGF) 信号肽序列 分泌型表达 载体 蓝藻
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