分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α－淀粉酶基因在枯草杆菌中的表达和分泌

利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克隆了枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列，将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒ｐＵＢ１８上，获得分泌型表达载体ｐＵＳ１８６。为了测试构建的载体ｐＵＳ１８６的功能，将地衣杆菌α－淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒，经过Ｂａｌ３１酶切，Ｔ４ＤＮＡ聚合酶补齐等处理，获得ｐＵＳＡ１８６Ⅱ及ｐＵＳＡ１８６Ⅰ系列质粒，将这些重组质粒转化枯草杆菌ＱＢ１１３０（ａｍｙ－）后都能向胞外分泌淀粉酶，酶活测定结果表明，基因表达水平比用原有的启动子高１－２倍，蛋白质分泌率在８４－９６％之间。

尖孢镰刀菌Six1d启动子的克隆及其在真菌分泌表达载体构建中的应用

前期研究中构建的真菌分泌表达载体p74HSP-EGFP可在真菌中表达目标蛋白,在真菌侵染并定殖植物的过程中分泌目标蛋白到植物中,从而验证目的基因的功能,但p74HSP-EGFP载体中驱动目的基因表达的毒素基因(toxin A,ToxA)启动子不是尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)自身的启动子。为能在Foc中更有效地表达其自身基因,本研究从尖孢镰刀菌1号生理小种(Foc1)中克隆到高丰度表达的木质部分泌蛋白基因(secreted in xylem 1d, Six1d)的启动子,来替换p74HSP-EGFP载体中的ToxA启动子,并将新构建的真菌分泌表达载体命名为pSix1d74HSPG。为比较2个分泌载体的表达效率,本研究进一步将p74HSP-EGFP和pSix1d74HSPG载体转化尖孢镰刀菌热带4号生理小种(Foc TR4),获得的转化菌株分别在钾盐液体培养基(KK)中振荡培养5 d后,检测分泌到胞外的EGFP荧光强度和EGFP蛋白的表达量。结果显示,pSix1d74HSPG中Six1d启动子驱动的EGFP表达强度能够达到p74HSP-EGFP中ToxA启动子驱动的1.6~1.7倍,说明pSix1d74HSPG载体可代替p74HSP-EGFP载体在Foc中更高效分泌表达目的蛋白,为香蕉枯萎病抗感病分子机理研究提供重要的实验工具。

一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体的构建

用化学法合成克鲁维酵母的菊粉酶基因的信号肽序列 (INU) ,将其嵌入酵母附加型表达质粒pYES2 ,得到一套新型的分泌表达载体pYES2 I,pYES2 Ⅱ ,pYES2 Ⅲ。然后用PCR方法分别扩增大肠杆菌的天冬酰胺酶基因 (ASN)和短芽孢杆菌α 乙酰乳酸脱羧酶 (ALDC)基因 ,连接到INU下游 ,得到重组质粒pASN和pALDC。分别将这两个重组质粒转化酿酒酵母菌株IN VScⅠ中表达 ,胞内和胞外的酶活分析表明ASN和ALDC基因都能在酿酒酵母中分泌表达 ,表明菊粉酶信号肽序列能很好地将酿酒酵母中的重组蛋白分泌到胞外。稳定性分析表明 ,重组酵母菌株在没有选择压力的条件下连续接种培养 1 0 0h 。

短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建

应用PCR技术从具有分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活性的短短小芽孢杆菌 5 0中分离出细胞壁蛋白基因的多启动子和信号肽编码序列 ,利用它与质粒pUB110和pKF3一起构建成穿梭分泌表达载体pBKE5 0。将α 淀粉酶基因引入该载体转化短短小芽孢杆菌 5 0后 ,发现α 淀粉酶可以活性形式分泌表达。此工作为下一步建立短短小芽孢杆菌高效分泌表达系统奠定了基础。

人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确。结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础。

E．coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E．coli中的分泌性表达

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点，在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ位点，组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－１．之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体，使之在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分泌表达，另采用ｐＩＮⅢ载体系统以分泌方式表达了人表皮生长因子。

hsBLyS分泌型表达载体构建及CHO表达

本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突变同义密码 ,最终重组质粒成为分泌表达质粒 ;磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV dhfr,共转染CHO—dhfr- 细胞 ;选择培养液筛选 ,氨甲喋呤扩增表达 ,获稳定表达rhsBLyS细胞株 ;ELISA检测浓缩表达上清 ,结果表明 :rhsBLyS表达量由 0 13 μg/mL上升至 0 5 5 μg/mL .

应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体

应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源ＤＮＡ编码序列，表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质，操作十分简便。

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α─ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３─磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳｐＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα基因启动子和信号序列及ＵＡＳＰＧＫ片段，构建成含ＭＦα基因启动子和信号序列的表达分泌型载体ＹＥｐ５１０１及含ＭＦα启动子和信号序列与ＵＡＳＰＧＫ的强化表达分泌型载体ＹＥｐ５１０２。这两种载体可用于外源基因表达的比较研究，探讨ＵＡＳ对外源基因表达的调控作用。

人血管抑素基因分泌型融合载体的构建与表达

【目的】构建人血管抑素(angiostatin,As)原核分泌型融合表达载体pEZZ18-As,诱导表达As融合蛋白。【方法】根据人AscDNA序列的开放读码框架设计上、下游引物,从人肝组织中提取总RNA后,利用RT-PCR技术扩增As基因;酶切目的基因与pEZZ18载体,回收纯化后做定向克隆连接,转化E.coliDH5α;XbaⅠ及EcoRⅠ双酶切电泳与测序鉴定pEZZ18-As;诱导培养重组菌,表达目的蛋白。【结果】酶切pEZZ18-As,电泳分析插入片段长度为1111bp,与预期结果一致,对连接点两端进行测序,结果显示接头两端序列连接正确;SDS-PAGE分析诱导培养重组菌,新出现的蛋白大小约61kD,与预期相符。【结论】成功构建人血管抑素表达载体并表达出目的蛋白,该研究为抗血管药物治疗实体瘤奠定了基础。

一株分泌型铁载体真菌分离鉴定及生物活性研究

从云南省国家自然保护区哀牢山原始森林土壤环境中分离1株分泌型铁载体真菌,并探讨了其对罹烟草青枯病土壤微生物生理生化功能的影响,为菌株的开发利用提供理论依据。稀释涂布法从土壤样品中分离纯化分泌型铁载体真菌菌株,形态学结合rDNA-ITS基因序列鉴定菌株分类学地位。铬天青S(chromeazurol S,CAS)液检测法结合全波段紫外光吸收法,判定铁载体化学结构类型,检测其活性。DNS比色法和Biolog-ECO分析法,分析菌株次生代谢产物对罹烟草青枯病土壤酶活性和微生物代谢的影响。结合形态学观察结果和序列对比分析鉴定该分泌型铁载体真菌为百岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae);菌株分泌型铁载体的化学结构类型为羧酸盐型(carboxylates),铁载体活性为78.79%。菌株次生代谢产物可显著提高土壤蔗糖酶和脲酶活性(P<0.05),分别提高13.7%和14.46%;菌株次生代谢产物亦可显著提高碳源利用能力:平均颜色变化率(average well color development,AWCD)和多样性指数(Shannon指数和Richness指数),分别提高86.15%、50.43%和66.67%。原始森林土壤环境贮藏铁载体微生物资源,利用菌株分泌型铁载体介导改善土壤微生物群落生理生化功能是实施土壤生态系统的优化管理的重要技术手段。

芽孢杆菌分泌型表达载体的构建

以地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶信号肽编码区为基础构建了具有Pst Ⅰ、Nhe Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ、Sal Ⅰ多酶切点的芽孢杆菌分泌型载体pAMY403,其分泌效率与质粒pAMY 413相同,而表达水平提高了50%,并能使外源β-内酰胺酶基因正常表达和分泌。质粒pAMY403的多酶切点可以满足外源基因插入产生非融合蛋白质,也可满足以三种不同读码框架插入外源基因产生融合蛋白质,因而能适应构建不同分泌型工程菌株的要求。

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaI酶切位点。通过XhoI和XbaI位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105I酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因(cbh2)的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余氨基酸。

人bFGF卵清蛋白分泌表达载体的构建及分析

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的卵清蛋白分泌表达载体,为建立鸡输卵管生物反应器奠定基础。方法:利用PCR手段,从鸡基因组DNA克隆了4.1k(-4050bp～+42bp)卵清蛋白(ovalbumin)上游调控序列,利用重叠PCR技术,将溶菌酶信号肽(lysozyme signal peptide)基因与人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因融合在一起。结果:经DNA测序和核酸电泳检测,OV启动子基因序列、pcsbFGF和pcOV-sbFGF电泳位点与预计结果一致。结论:人bFGF的卵清蛋白分泌表达载体构建初步完成,可进行进一步转染表达。

分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type Ⅰ,HIV-1)负性调节因子(nega-tive regulation factor,Nef)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法:利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果:限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef-EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论:成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef-EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。

应用CTB基因启动子及信号肽序列构建分泌性表达系统

利用霍乱毒素B亚基基因的启动子、信号肽序列及ctx操纵子的转录终止信号构建了分泌性表达的质粒载体pMC05S。β-半乳糖苷酶基因克隆至霍乱毒素B亚基基因的信号肽序列下游后能得到高效分泌性表达。不同的宿主菌和培养基成分中对β-半乳糖苷酶的表达产量有较大的影响,以MM2为宿主菌、在玉米浆培养基中β-半乳糖苷酶的表达产量达4100u/ml,产物的大部分分泌至细胞的周质;活力测定的结果与SDS-PAGE电泳测定结果基本一致,说明表达的β-半乳糖苷酶绝大部分都具有酶活性。构建的蛋白质分泌性表达的载体-宿主系统及合适的培养条件为易形成包含体的蛋白质的高效表达提供了一条新的途径。