无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞

背景:目前临床上尚未发现完全治愈脊髓损伤,使其达到结构及功能恢复的治疗方法。已有的神经营养因子治疗方法促进神经细胞再生的效果有限,而干细胞移植治疗可能是现阶段修复脊髓损伤的有效方法之一。目的:无血清悬浮分离培养法培养胎鼠脊髓源性神经干细胞,采用形态学、免疫荧光技术和多向分化能力进行神经干细胞鉴定。方法:应用悬浮分离培养法,培养纯化孕13.5 d C57BL/6胎鼠的脊髓源性神经干细胞。倒置显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8法检测细胞的增殖能力。免疫荧光技术检测Nestin和Sox2表达;使用自然分化法验证第4代脊髓源性神经干细胞多向分化特性,明确其分化能力。结果与结论:采用无血清悬浮分离培养法可以顺利获取脊髓源性神经干细胞。培养的脊髓源性神经干细胞增殖活性良好,高表达Nestin和Sox2,且两种标记物与DAPI核染高度均匀吻合,说明细胞纯度高。进一步诱导分化显示,细胞可以向GFAP和Tuj1阳性细胞分化,证明脊髓源性神经干细胞分化潜能较好。该实验可建立一套体外培养脊髓源性神经干细胞分离、培养、纯化及鉴定体系,为后续神经干细胞的应用研究奠定基础。

分离培养法与涂片镜检法在诊断女性淋球菌感染的临床应用比较

目的评价分离培养法与涂片镜检法在诊断女性淋球菌感染的临床应用价值。方法选取2010年6月至2012年6月在该院性病门诊或住院病房疑似诊断为淋球菌感染的女性患者360例,患者大多具有淋病的流行病学和临床特征,临床症状主要表现为外阴刺痒和烧灼感等症状,体检检查发现宫颈红肿、糜烂、脓性白带、口腔、直肠肛门及其他局部病灶等。收集、整理临床资料及数据,并进行回顾性分析,比较两种方法的临床价值。结果 360例疑是淋球菌感染患者,用涂片染色法检测阳性289例(80.3%),阴性71例(19.7%);用分离培养法检测阳性275例(76.4%),阴性85例(23.6%),总的淋球菌感染者应用涂片染色法及分离培养法检测,两者比较结果差异无统计学意义(χ2=1.60,P=0.12>0.05);其中疑是泌尿生殖道感染264例中,涂片染色法检测阳性216例(81.8%),阴性48例(18.2%);用分离培养法检测阳性204例(77.3%),阴性60例(22.7%);两者比较结果差异无统计学意义(χ2=1.67,P=1.18>0.05);疑是口腔感染45例中,涂片染色法检测阳性28例(62.2%),阴性17例(37.8%);用分离培养法检测阳性21例(46.7%),阴性24例(53.3%),两者比较结果差异有统计学意义(χ2=7.52,P=0.005<0.05);肛门直肠感染及其他局部病灶等51例中,涂片染色法检测阳性42例(82.4%),阴性9例(17.6%);用分离培养法检测阳性32例(62.7%),阴性19例(37.3%),两者比较结果差异有统计学意义(χ2=4.92,P=0.02<0.05)。结论两种检测方法相互结合应用,有利于提高诊断正确性,降低假阴性、假阳性等,提高淋病检测方法的敏感性、特异性,对淋球茵感染的实验诊断具有十分重要的意义。

实时荧光定量聚合酶链反应法与分离培养法在流感病毒鉴定中的关系研究

流感是至今尚无法完全控制的一种病毒性急性呼吸道传染病,同时也是国际上第一个实现全球监测的传染病[1]。为使阳泉市流感监测走向系统、全面和科学化,阳泉市疾病预防控制中心于2009年加入全国流感监测网络实验室,现将2015—2019年实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测阳性样本进行分离培养,分析CT值与流感病毒分离率的影响关系。

联合使用胶体金法和分离培养法在霍乱检测和诊断工作中的应用

霍乱具有发病快、易流行、危害严重的特点，早发现、早诊断对于霍乱防治工作尤为重要。单独使用分离培养法、胶体金法、PCR检测法均不能很好地早期发现霍乱疫情，而联合使用胶体金法、分离培养法可以充分发挥其各自优势，具有检测速度快、高灵敏度、高特异度的特点，且具有价格低廉的优势，适用于基层卫生系统进行有效的霍乱防治工作，具有推广意义。

食品卫生检验中LAMP法和分离培养法检测沙门菌属的比较评价

目的探讨食品卫生检验中LAMP法检测沙门菌属的实际应用效果。方法将153份食品样品分别通过LAMP法和分离培养法检测沙门菌,比较两组阳性检出率。结果 LAMP法阳性检出率(14.38%)高于分离培养法(7.84%),差异有统计学意义(P<0.05);两组阳性符合率为83.33%(10/12),阴性符合率为91.49%(129/141),差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论 LAMP法应用于食品中沙门菌检测具有快捷、方便、阳性检出率高、结果准确等优点,值得推广。

4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。

环境水中嗜肺军团菌的分离培养法和巢式PCR法比较

目的应用传统分离培养法和巢式PCR法检测环境水中嗜肺军团菌污染状况,并比较两种方法的检测效果。方法于2012年7-10月,采集北京市丰台区商场和超市、宾馆和饭店、综合性医院三类场所的中央空调冷却水、自来水、淋浴水、景观水,分别使用培养法及巢式PCR法检测嗜肺军团菌。结果共检测187件水样,传统分离培养法对嗜肺军团菌的检出率为2.67%（5/187）,低于巢式PCR法[19.79%（37/187）],差异有统计学意义（χ-2=27.465,P〈0.01）。结论北京丰台区多种环境水体存在嗜肺军团菌污染;巢式PCR法对环境水中嗜肺军团菌的灵敏度优于传统分离培养法。

实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究

目的比较实时荧光定量PCR法(RT-PCR)与分离培养法对食品从业人员肠道致病菌沙门菌和志贺菌的检测效果。方法 1RT-PCR法:用实时荧光定量PCR对体检肛拭子进行初筛;2分离培养法:按照国标方法GB/T 4789.4—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》和GB/T 4789.5—2003《食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验》对所筛选出的菌株进行鉴定。结果 RT-PCR法对食品从业人员肠道沙门菌和志贺菌的检出率明显高于分离培养法。结论 RT-PCR法相对于分离培养法在从业人员体检沙门菌和志贺菌的检测中,无论从检出率、准确度,还是检测时效性上都有着明显的优势。因此,在从业人员体检中运用RT-PCR法具有很好的实际意义。

实时荧光PCR法、胶体金快速检测法及病毒分离培养法在甲型流感病毒检测中的临床应用分析

目的:评估三种常见甲型流感病毒检测方法临床应用领域。方法:采用实时荧光PCR法、胶体金快速检测法及病毒分离培养法同时对244份临床标本进行甲型流感病毒检测,进行统计分析,评估不同方法灵敏度、特异性差异。结果:实时荧光PCR法、胶体金快速检测法、病毒分离培养法检测阳性率分别为73.77%,59.02%,40.16%;与实时荧光PCR法相比,胶体金快速检测法灵敏度、特异度分别为68.33%,67.19%;病毒分离培养法分别为54.44%,100%;与病毒分离培养法相比,胶体金快速检测法灵敏度、特异度分别为92.86%,63.70%。结论:实时荧光PCR法灵敏度、特异度高,适于确诊;胶体金快速检测法灵敏度较低,特异度最低,适于初筛;病毒分离培养法灵敏度较低,特异度高,适于做深入抗原分析。

集中空调通风系统冷却塔水中嗜肺军团菌的Legiolert酶底物法与分离培养法比较

目的评价Legiolert酶底物法与《公共场所卫生检验方法第五部分:集中空调通风系统》(GB/T 18204.5—2013,以下简称"分离培养法")在集中空调通风系统冷却塔水中嗜肺军团菌检测中的应用。方法对112件武汉市集中空调通风系统冷却塔水水样分别采用Legiolert酶底物法与分离培养法进行嗜肺军团菌检测。结果Legiolert酶底物法对水样中嗜肺军团菌的检出率为83.04%(93/112),高于分离培养法检出率[73.21%(82/112)],差异有统计学意义(P<0.05)。结论对于集中空调通风系统冷却塔水中嗜肺军团菌的检测,Legiolert酶底物法的检出率优于分离培养法。

食品中大肠杆菌O157∶H7快速分离培养方法的研究

为检测食品中大肠杆菌O15 7∶H7,本研究通过优化培养基成份和筛选选择性抑菌物质设计了一种选择性分离鉴别培养基 ,CTV MUG RSMAC琼脂。使用该培养基不仅可有效抑制杂菌的生长 ,还能同时鉴定大肠杆菌O15 7∶H7的三种主要生化特征———不发酵山梨醇、不发醇鼠李糖、不分解MUG ,可避免漏检发酵山梨醇的大肠杆菌O15 7∶H7变异株。样品用选择性增菌肉汤 42℃培养过夜后 ,在CTV MUG RSMAC平板上划线接种 ,37℃培养 2 4小时 ,挑选特征菌落做O15 7、H7抗血清凝集试验和肠杆菌科主要生化试验 ,整个程序可在 3天内完成。检测了 12 6份食品样品 ,结果检出 3份阳性 ,与用FDA方法的检测结果一致。

C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的改良和鉴定

目的建立一种体外纯化及培养扩增C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的简单有效方法。方法利用骨髓MSCs在体外培养皿中培养时具有贴壁生长的特性,采用全骨髓法分离培养C57/BL6小鼠MSCs,通过体外培养和连续传代达到纯化和扩增MSCs目的,并与以优化。倒置显微镜下观察细胞形态变化情况;利用四唑盐比色(MTT)法测定MSCs的生长曲线;流式细胞仪(FCM)鉴定MSCs膜抗原。结果 C57/BL6小鼠胫骨全骨髓细胞在分离后与含15%优质胎牛血清DMEM/F12培养基混合,约5～10min后即可见大量有核细胞贴壁,细胞形态为圆形,24～48h后可见贴壁细胞转变为椭圆形、多角形及短梭形,7～12d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。通过传代细胞进一步纯化及扩增。细胞传代后2d内处于潜伏期,3d后进入生长期,5d后进入平台期。第4代MSCs进行FCM检测CD45、CD44、CD29和CD54阳性率分别为2.4%、83.2%、95.1%和94.1%。激光免疫共聚焦结果显示造血细胞表面标物CD34和CD45阴性,而CD44和CD105阳性。结论 C57/BL6小鼠全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的MSCs,用此方法培养的C57/BL6小鼠MSCs生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,可以为组织工程提供理想的种子细胞。

贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法。研究MSCs的生物学特性,为血管组织工程提供理想的种子细胞。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSCs体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;利用MTT法测定MSCs的生长曲线;行免疫组化方法鉴定MSCs膜抗原;分别加成骨、成脂肪诱导剂后MSCs体外培养1到3周,分别做碱性磷酸酶(ALP)、VonKossa染色及油红O染色,观察细胞形态变化、成骨及成脂肪分化结果。结果MSCs体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,表达波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),不表达层粘连蛋白(Laminin)、CD34、VIII因子相关抗原(VIII)。经体外诱导后具有多向分化潜能。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSCs,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,为其成为血管组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。

MALDI-TOF MS技术结合分离胶促凝管短时培养法对快速鉴定革兰阴性杆菌血流感染的符合率研究

目的探析基质辅助激光电离解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术结合分离胶促凝管短时培养法在快速鉴定革兰阴性杆菌血流感染中的应用及其符合率。方法选择2020年1月-2022年2月收集的112例革兰阴性杆菌感染者血液样本为研究对象。用分离胶促凝管直接从血培养瓶中富集并提纯菌体,用MALDI-TOF MS技术进行菌种鉴定,同时采用全自动微生物分析系统进行鉴定。比较两种鉴定方式的检出结果及符合率。结果112例革兰阴性杆菌感染血液样本中,MALDI-TOF MS结合分离胶促凝管短时培养法的检出率为94.69%,全自动微生物分析法的检出率为100.00%。与全自动微生物分析法相比,MALDI-TOF MS结合分离胶促凝管短时培养法的革兰阴性杆菌水平鉴定正确率达82.69%。结论MALDI-TOF MS结合分离胶促凝管短时培养法在革兰阴性杆菌血流感染鉴定中,能达较理想的检出效果,且具有操作便捷、成本低廉、确诊率高、检出效率高等优势,对给予患者有效且有针对性的抗菌药物治疗有重要作用。

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的方法,研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC,体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;利用四唑盐比色(MTT)法测定MSC的生长曲线;流式细胞仪(FCM)鉴定MSC膜抗原。结果原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期,3天后进入生长期,7天后进入平台期。FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。