姐妹染色体过早分离基因5黏附相关因子B(PDS5B)下调Wnt5a表达抑制A549人肺癌细胞增殖

目的探讨姐妹染色体过早分离基因5黏附相关因子B(PDS5B)对A549肺癌细胞株生物学功能的影响及可能的分子机制。方法沉默或过表达A549人肺癌细胞的PDS5B后,噻唑蓝(MTT)法及集落形成实验检测肺癌细胞的增殖情况;划痕实验及TranswellTM检测细胞迁移的情况;Western blot法检测A549细胞PDS5B及无翅基因5a(Wnt5a)的蛋白表达;共同转染PDS5B小干涉RNA(siRNA)及Wnt5a siRNA,TranswellTM检测细胞迁移的情况。结果与转染阴性对照组相比,转染PDS5B siRNA后,PDS5B蛋白表达明显下降且A549细胞增殖能力、细胞集落形成率、迁移能力均明显提高,Wnt5a的表达升高;过表达PDS5B后,则结果相反;共转实验显示Wnt5a可以抵抗PDS5B对A549细胞的抑制作用。结论PDS5B通过下调Wnt5a表达抑制肺癌细胞增殖。

Thermus thermophilus HB27质粒分离基因位点同系物parATth的功能研究

通过敲除噬热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27的parATth基因,获取parATth基因敲除突变体,并从染色体DNA的复制及子细胞分离等方面分析突变体的表现型,鉴定parATth的功能。结果显示:在parATth突变体中,未出现明显的细胞生长与分裂受阻现象,细胞形态也未发生变化;与野生株相比,突变株染色体DNA的拷贝数未发生变化,大区段染色体DNA的子细胞分离也未受阻,但染色体的复制起始位点(oriC)区域的亚细胞定位受到影响,其定位于细胞任意位置。综合分析,T.thermophilus HB27的parATth基因在大区段染色体DNA的子细胞分离过程中没有起关键作用,但其可能参与染色体复制起始位点区域的子细胞定位与分离。

基于启动子捕获系统的水稻基因的分离

为了分离水稻的基因及其启动子,该实验室构建了T-DNA(GUS)结构的水稻启动子捕获系统,对其中编号为113#、T-DNA单拷贝插入、GUS报告基因为组成型表达的阳性捕获系进行了进一步分析。潮霉素筛选结合GUS组织化学染色获得了T-DNA插入的纯合株(113#-22和113#-26);Inverse法分离得到T-DNA插入位点水稻基因组DNA旁邻序列,测序和BLAST结果表明,T-DNA反方向插在水稻基因组4号染色体预测基因的内含子中;扩增T-DNA插入位点上游2kb左右DNA片段,构建启动子分析质粒转化水稻‘中花11’胚性愈伤组织,获得转基因植株,GUS组织化学染色模式与113#阳性株系一致。结果表明,该预测基因及其启动子是利用启动子捕获系统所捕获到的候选基因。

甘薯NBS类抗病基因类似物的分离与序列分析

利用已克隆植物抗病基因NBS(Nucleotidebindingsite)序列中的保守模体(motif)“P-loop”和“GLPL”合成简并引物,以甘薯(Ipomoeabatatas)栽培品种青农2号基因组DNA为模板进行PCR扩增,通过T/A克隆、测序和序列分析,共得到15条具有连续ORF的抗病基因类似物(Resistancegeneanalogues,RGAs)序列,它们之间核苷酸序列间的相似性系数在41.2%-99.4%之间,而相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在20.6%-100%之间,同时对分离的RGAs的核苷酸和氨基酸序列进行系统发育树分析,表明甘薯RGAs可分为TIR(DrosophilaTollorhumaninterleukinreceptor-like)和nonTIR两类。对甘薯RGAs和5个已克隆植物NBS的氨基酸序列进行结构分析表明,它们包括“P-loop”、“Kinase-2”、“Kinase-3a”“、GLPL”4个抗病基因所共有的保守模体。这些表明甘薯与其它物种的NBS类RGAs可能具有同样的起源和进化机制。

矮泰引－2中半矮秆基因的分离与鉴定研究

矮泰引－２中半矮秆基因的分离与鉴定研究梁国华，潘学彪，顾铭洪，嵇朝球（扬州大学农学院农学系，扬州２２５００１，现在地址：江苏油田农场，江苏洪泽２２３１２５）关键词：基因分析；基因分离；半矮秆基因ＴｈｅＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＩｄｅｎｔｉ...

响应镉胁迫的水稻WRKY15转录因子基因的分离与表达特征

【目的】镉(Cd)是一种对植物生长发育和人类健康均具有很强毒害效应的重金属元素。WRKY转录因子在抗逆生理过程中起重要的调节作用。为了研究WRKY基因在镉胁迫响应和抗性反应中的作用,【方法】基于基因注释,采用RT-PCR策略从一氧化氮(NO)处理的水稻叶片中分离完整的Os WRKY15编码序列,运用生物信息学软件分析其编码蛋白的结构特征,采用q RT-PCR分析其基因的空间(器官)特异性及诱导表达模式;运用酵母单杂交方法检测其转录激活活性。【结果】克隆了Os WRKY15 c DNA序列,长988 bp,包含一个长825 bp的完整开放读码框,编码274个氨基酸。Os WRKY15具有1个典型的WRKY保守结构域,锌指类型为C2HC,归类于WRKY第3组;拥有一个核定位信号,因此推测为一种核蛋白。酵母单杂交分析表明,它具有转录激活活性。Os WRKY15在根中的表达丰度最高,其次是叶和茎,在颖果、花和干种子中的表达丰度较低;受Cd、NO和脱落酸(ABA)快速且显著诱导,且在根中被诱导的程度比叶中大,而水杨酸、茉莉酸和乙烯对其表达无明显影响。【结论】Os WRKY15是一个具有功能的核蛋白,推测其可能通过NO、ABA介导的信号途径参与水稻对Cd胁迫的抗性反应。

一类新的编码PRPs基因的分离及其在棉花纤维等组织细胞中的表达

富含脯氨酸的细胞壁蛋白(proline-rich proteins,PRPs)在植物中广泛分布,它们在建造围绕特定细胞类型的细胞壁结构上起着很重要的作用.从棉花的cDNA文库中分离了5个编码富含脯氨酸的细胞壁蛋白质基因,这5个基因推断的氨基酸序列最普遍的特点就是脯氨酸含量非常高.根据氨基酸组成、富含脯氨酸的重复单元和结构域组织的特点,将这5个蛋白质分成2个亚类:一类(包括GhPRP3-6)与典型的PRPs结构相似,由N端疏水区(或信号肽)与不同富含脯氨酸的重复序列组成;另一类(GhPRPL)与典型的PRPs结构不同,这个蛋白质的N端为亲水序列,GhPRPL在靠近C端有8个5肽(类似PPKKE)的重复基序,与典型PRPs所含有的重复序列PPVYK非常相似.实时RT-PCR(Real-time RT-PCR)分析表明,GhPRP3和GhPRP5在10dpa纤维中特异表达,而GhPRPL在子叶中优势表达.GhPRP4和GhPRP6在所分析的组织中都有表达,GhPRP4mRNA在下胚轴中最丰富,在花药中次之,而GhPRP6在10dpa纤维中表达最强,在10dpa胚珠中次之.此外,GhPRP3,GhPRP5基因表达受纤维发育调节,表明它们可能在棉纤维发育中起重要作用.

mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因

本文报道采用改良的mRNA差别筛选法，通过选用3'锚定引物和18-25碱基的PCR随机引物组合，以琼脂糖凝胶电泳，EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，对低温处理草菇(Volvariella volvacea)及正常草菇基因表达进行筛选、分析，结合RNA斑点杂交技术加以验证，分离得到70个草菇低温诱导DNA片段。

野生稻NBS类抗病基因同源序列的分离与序列分析

为了挖掘野生稻中的抗病资源,根据已克隆的植物抗病基因核苷酸结合位点序列中的保守结构域设计3对简并引物,从疣粒、药用、高秆、宽叶和斑点野生稻基因组DNA中分离出13条NBS类抗病基因类似物,其中11条具有连续的ORF,具有NBS类R基因的保守基元P-loop、kinas-2、kinas-3a和GLPL。在NCBI上进行同源性搜索发现,其中12条RGAs的核苷酸序列与水稻已知的NBS类R基因具有66%～94%的同源性,与其他植物已知R基因具有67%～84%的同源性;其对应的氨基酸序列与水稻已知的NBS类R基因具有43%～93%的同源性,与其他植物已知R基因具有37%～79%的同源性。另外1条的核苷酸序列与水稻假定的NBS类R基因具有76%的同源性,其氨基酸序列与水稻假定的NBS类R基因具有74%的同源性。根据序列分析结果设计6对不同基因特异性引物,并利用RT-PCR技术进行表达分析,结果表明,RN1BD5、RN1BD10、RN1GG2和RN1YY6均能表达,说明这些片段可能是功能性抗病基因的部分序列;而RN1KY9和RN1GG5没有表达,可能是假基因。

通过cDNARDA法分离和识别盐藻(Dunaliella salina)盐胁迫相关基因

采用cDNA代表性差异分析 (RDA)技术 ,对盐藻在盐胁迫时差异表达的基因进行了分离鉴定 .在分离到的 10个基因中 ,有 5个与已知基因同源 (包括叶绿素a b结合蛋白基因、蛋白磷酸酶I催化亚基基因和 3个核糖体蛋白基因 ) ,还有 5个未知功能基因则是首次在盐藻中被分离 .值得注意的是 ,所有这 5个已知基因的功能都与细胞分裂或盐胁迫有关 .结果表明 :取样时盐藻细胞仍处于恢复阶段 ,所分离到的基因对于盐藻耐盐可能具有重要意义 ;蛋白磷酸酶I的下调表达可能是盐藻调节离子平衡的一个重要过程和细胞分裂受阻的原因所在 ;盐藻减缓细胞分裂速度可能是为了减少能量消耗 ,以留出足够的能量来应对盐胁迫 ;其它 5个未知基因可能也与盐藻适应盐胁迫机制有关 .

水稻转基因植株后代中外源基因异常分离的研究

以用农杆菌介导法育成的日本晴等 3个品种 (系 )的转基因水稻为材料 ,对外源基因的分离情况进行了研究。这几份转基因水稻都携带串联排列的抗虫基因cry1Ab和报告基因gusA等基因。在自交后代中 ,cry1Ab和gusA协同分离 ,但阳性植株与阴性植株之比都显著小于 3∶1,阴性植株显著偏多。以杂合转基因植株 (gusA/ - )作母本植株 ,与常规品种 (- / - )杂交所得测交F1,阳性植株 (+/ - )和阴性植株 (- / - )的比例基本符合 1∶1。在反交时 ,阴性植株与阳性植株之比显著大于 1∶1的比例。比较日本晴转基因后代中gusA阳性株与阴性株的结实率发现 ,前者的结实率显著低于后者。综合上述结果可以看出 ,携带crylAb等转基因的花粉存在竞争劣势 ,可能是导致外源基因异常分离的主要原因。

水稻WRKY80转录调节蛋白基因的分离与表达模式

【目的】分离水稻WRKY80,分析其编码蛋白的序列结构特征,了解其在各器官中以及病原接种、激素处理下的表达模式,为阐明其生物学功能奠定基础。【方法】基于水稻基因组数据库注释的Loc_Os03g63810基因的编码序列设计特异引物,用RT-PCR法从茉莉酸甲酯(MeJA)处理的水稻叶片中克隆WRKY80 cDNA序列,运用生物信息学手段对推定的蛋白和启动子序列进行分析,用Northern杂交或实时荧光定量PCR方法研究基因的表达模式。【结果】获得了WRKY80 cDNA序列,长1 392 bp,包含1个长1 164 bp的完整开放读码框,编码387个氨基酸。WRKY80具有1个典型的WRKY保守结构域,锌指类型为C2H2,归类于WRKY第Ⅱ组;C-端为酸性结构区,且含连续的6个谷氨酰胺和8个丝氨酸,提示具有转录激活活性;预测其定位于细胞核。WRKY80与玉米和高粱等单子叶植物WRKY的氨基酸序列同一性较高。WRKY80在各器官中组成性表达,在叶、根和穗中表达丰度较高,花中次之,在茎和颖果中丰度较低,且表达具有发育阶段相关性,在成熟叶、根中的表达分别高于幼叶和幼根;受稻瘟病菌、纹枯病菌、MeJA和乙烯利诱导表达,而水杨酸对其表达无影响。其表达模式与启动子顺式元件预测分析的结果基本一致。【结论】WRKY80具有转录因子的结构特征,推测其可能通过茉莉酸/乙烯介导的信号途径参与水稻的防御反应,也可能参与发育调控。

海水养殖鲈鱼分离出一种hepcidin抗菌肽新基因

利用分子生物学技术,从我国海水养殖鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)分离到一种hepcidin抗菌肽新基因,并在国际GenBank公布(accessionnumber为AY547281).初步研究结果表明,在我国鲈鱼分离到的hepcidin基因属于hep cidin抗菌肽基因家族的新成员.

图位克隆技术在农作物基因分离中的应用与评价

图位克隆(Map-based cloning)作为分离基因的有效方法,已在小基因组作物的基因分离中得到了广泛应用和发展,而在具有大量重复DNA序列的大基因组作物中的应用仍存在挑战。基于图位克隆在基因分离中的重要性,文章就图位克隆技术的基本内容及发展做简要概述,着重对图位克隆技术在大基因组作物中的应用进行分析和评价,同时对它今后可能的发展方向进行了讨论,以期为大基因组作物基因的分离提供借鉴。

mRNA差异显示技术在分离水稻基因中的应用

mRNA差异显示技术是分子生物学中分离g隆基因的有效技术。笔者叙述了mRNA差异显示技术的基本原理、存在的问题以及技术改进, 并主要阐述了该技术在分离水稻基因中的应用情况。

海南普通野生稻Waxy基因的分离和序列分析

根据已报道的栽培稻Waxy基因序列设计引物,对海南普通野生稻Waxy基因的DNA序列和cDNA序列进行克隆和鉴定。获得Waxy基因编码区的DNA序列3 330 bp,cDNA序列1 860 bp,该基因编码区存在13个外显子和12个内含子,编码609个氨基酸残基。海南普通野生稻与其他水稻Waxy基因序列之间存在显著差异,并且主要体现在内含子上,推测其可能影响Waxy基因的转录水平。Waxy基因聚类分析表明,栽培稻与海南普通野生稻亲缘关系较近。

籼稻品种浙辐802抗稻瘟病基因的鉴定与分离

浙辐802是20世纪90年代在中国南方稻区大面积种植的籼稻品种,它对北方稻区的菌株表现很宽的抗谱。利用2个致病性稳定的稻瘟病菌系对浙辐802(ZF802)与普感品种丽江新团黑谷(LTH)杂交的F1、F2、BC1F1群体进行抗病性遗传分析,从ZF802中鉴定出2个抗病基因Pi-ZF1(t)和Pi-ZF2(t),它们都抵抗供试菌系研54-04,其中Pi-ZF1(t)基因也能抵抗供试菌系95-t2,而Pi-ZF2(t)基因对该菌系无效。根据F3和F4株系对供试菌系在抗性表型上的差异,对ZF802携带的抗病基因进行分离,从上述杂交组合的F4株系中获得纯合Pi-ZF1(t)基因的株系6个,纯合Pi-ZF2(t)基因的株系9个。

一个小麦低分子量谷蛋白基因的分离

以新疆小麦日喀则基因组DNA为模板,采用G lu-D 3位点特异引物进行PCR扩增。PCR产物插入pUCm-T载体,转化感受态大肠杆菌E.coli DH 5α,获得阳性克隆。经测序发现该插入片段长度1 287 bp,包括了部分启动子序列和完整的编码序列。编码序列推导的蛋白质含有8个半胱氨酸残基,属于6类LMW-G S中的T ypeⅠ类,为以后这类基因的功能研究提供了基因材料。

用差异显示法从人胎脑基因文库分离一个编码序列

人１８周、２２周胎儿脑、肝肾组织总ｍ ＲＮＡ 用ＤＤＲＴ－ＰＣＲ显示出差异的条带，回收胎脑和肝肾特异性表达的４８７条电泳条带．其中某些条带用３种组织的ｃＤＮＡ 探针作点杂交，筛选只对胎儿脑总呈阳性的ＤＮＡ 片段．以其中某一条带ＤＮＡ 为探针，从胎儿脑ｃＤＮＡ 文库筛选阳性克隆，得到ＧＣ５８．经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交和ＤＮＡ 测序，表明它是人脑表达的序列，与数据库中ＫＩＡＡ０５１５有同源性，并编码一个有２７４个氨基酸的蛋白质，该蛋白质序列尚未见报道．探讨了ＤＤＲＴ－ＰＣＲ的条件和假阳性问题．

小体鲟HSP70基因全长cDNA序列的分离及表达分析

采用RT-PCR法首次从小体鲟(Acipenser ruthenus)肝脏RNA分离获得HSP70基因全长cDNA序列(HSP70cDNA)。生物信息学分析显示,小体鲟HSP70基因含有众多的蛋白激酶C磷酸化位点,Ser、Thr、Thy磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号转导与调控中发挥作用。经过BLAST比对,认为该序列与西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)、斑点叉尾鮰(Ietalurus punetaus)、斑马鱼(Danio rerio)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲爪蟾(Xenopus lae-vis)、中华鳖(Pelodiscus sinensis)、原鸡(Gallus gallus)、家鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的同源性均在80%以上,表明HSP70具有高度的保守性。组织表达分析表明,HSP70mRNA在小体鲟肝脏、心、脾、脑、肾、肌肉、胃、肠、垂体、精巢和卵巢组织中均有表达,但表达量不同,心脏、脾和肝脏中表达量高,脑、垂体和性腺中表达较少,鳃中没有表达。小体鲟HSP70基因的表达分析为研究应激条件下鲟科HSP70基因的差异表达和抗逆机理提供了基础。