采用胶原酶Ⅱ循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞活性及瞬时外向钾电流观察

目的通过观察采用胶原酶Ⅱ循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞形态、活性及瞬时外向钾电流,以验证胶原酶Ⅱ循环灌流消化法对心肌细胞急性分离的效果。方法利用自制Langerdorff灌流装置进行主动脉逆行灌流,胶原酶Ⅱ循环灌流消化,分离成年大鼠单个心肌细胞;利用逐步梯度复钙法选出耐钙心肌细胞;在共聚焦显微镜下观察单个心肌细胞的形态、舒缩能力,并用全细胞膜片钳记录心肌细胞瞬时外向钾电流。结果胶原酶Ⅱ循环灌流消化法分离大鼠心肌细胞可获取90%质量良好的细胞,分离出来的心肌细胞边缘锐利、横纹清晰,折光性强,舒缩规律;复钙后仍有60%质量良好的活细胞;用全细胞膜片钳可记录到标准的瞬时外向钾电流。结论采用胶原酶Ⅱ循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞活性较好且耐钙,可记录到标准的瞬时外向钾电流。

适合膜片钳实验的心肌细胞分离方法研究

目的:摸索并建立简便可行的适于做膜片钳实验的心肌细胞急性分离方法。方法:采用自行改进的Langendorff心脏灌流装置,用无钙台氏液和酶解液逆行主动脉灌流之后,剪取心肌组织置于KB液中保存以供全细胞膜片钳方式记录电流。结果:分离所得80%～90%的细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰,可记录到典型的快钠电流。结论:控制好分离心肌细胞的实验条件以及熟练掌握实验操作的方法,是分离出适合于膜片钳实验的心肌细胞的重要因素。

葛根素抗心肌细胞过氧化氢损伤的线粒体相关机制

目的:探讨葛根素(puerarin,Pue)预处理抗过氧化氢(H2O2)应激损伤的作用是否与线粒体渗透性转换孔和/或线粒体钙激活钾通道有关。方法:采用酶解分离大鼠心肌细胞模型,台盼蓝拒染法测定心肌细胞存活率;Rhodamine123孵育测定线粒体膜电位值,分离线粒体测定mPTP孔开放程度。结果:与H2O2应激组相比,Pue(0.24mmol/L)预处理5min可明显对抗H2O2应激引起的心肌细胞存活率的降低,线粒体钙激活钾通道阻断剂paxilline(Pax,1μmol/L,预处理30min)、线粒体渗透性转换孔开放剂atractyloside(20μmol/L,预处理20min)或PKC抑制剂chelerythrine(5μmol/L,预处理30min)可拮抗Pue的作用。Pue预处理或钙激活钾通道开放剂NS1619(10μmol/L,10min)都明显减弱H2O2应激引起的线粒体膜电位的去极化,线粒体渗透性转换孔开放剂atractyloside能明显减弱Pue的作用。在分离心肌线粒体模型上,Pue(0.24mmol/L,5min)显著减弱CaCl2诱导的线粒体在A520处吸光度降低,Pax(1μmol/L,5min)可拮抗Pue的作用。结论:在大鼠分离心肌细胞模型或分离线粒体模型上,Pue预处理具有抗过氧化氢应激损伤的作用,这种保护作用可能与其抑制线粒体渗透性转换孔的开放和促进线粒体钙激活钾通道的开放有关。

胰岛素促进模拟缺血/再灌注心肌细胞收缩功能恢复:Akt的关键作用

采用单心肌细胞动缘探测技术观察了胰岛素对成年大鼠模拟缺血/再灌注(I/R)心肌细胞收缩/舒张功能及钙瞬变的影响, 并探讨了上述作用与心肌蛋白激酶 B(Akt)的关系. 发现胰岛素(0.01 ～ 10.00 IU/L)浓度依赖性地使再灌注后心肌细胞肌小节收缩幅度、收缩/舒张速度以及钙瞬变增大; 此时心肌磷酸化Akt增加242%(与对照组相比P < 0.01), 该作用可被3-磷脂酰肌醇激酶(PI3-kinase)特异性阻断剂LY 294002阻断, Akt磷酸化仅增加43%(与胰岛素组比P < 0.05), 而且胰岛素上述正性变力作用亦同时被明显抑制. 结果表明, 胰岛素可增强I/R心室肌细胞收缩及钙瞬变, 促进再灌注后心肌细胞收缩/舒张功能的恢复, 该作用依赖PI3-kinase-Akt的激活.