群体分离分析法在食用菌遗传研究中的应用进展

群体分离分析法(bulked segregant analysis,BSA)是一种利用分离群体快速鉴定基因组特定区域遗传标记的方法。随着高通量测序技术的快速发展,再加上BSA简便、高效、低成本等优势,目前BSA已广泛应用于植物基因定位,但其在食用菌中的应用还处于起步阶段。综述了BSA及其在食用菌遗传研究中的应用现状,并展望其在食用菌遗传研究中的应用前景,为今后利用BSA开展食用菌遗传研究提供参考。

群体分离分析法(BSA)在植物基因定位上的应用

利用群体分离分析法是快速有效地寻找与质量性状基因紧密连锁分子标记的主要途径之一。近年来,BSA法在各种不同植物的育性基因、抗病基因、抗虫基因及形态、生理基因的标记筛选及基因定位方面取得了很大的进展。

黄瓜白粉病抗性基因定位及候选基因分析

【目的】通过对黄瓜白粉病抗性基因的精细定位,明确抗性基因的候选区段,为进一步克隆基因及解析基因功能奠定基础。【方法】本研究选用高抗白粉病资源(自交系‘74’)和感白粉病资源(自交系‘80’)配制杂交组合,构建F_1、F_2群体,利用单囊壳白粉菌鉴定亲本及群体白粉病抗性并进行遗传分析;采用BSA-seq的方法对黄瓜白粉病抗性基因进行初步定位,在此基础上在候选区段开发分子标记,进一步精细定位白粉病抗性基因。【结果】分离群体单株表型鉴定结果表明,自交系74的抗性是由不完全隐性基因控制的。BSA-seq技术初步将抗性基因定位于5号染色体15—25 Mb位置,命名为PM 74。最终,利用分子标记将抗性基因定位于SSR15321和SSR07531之间,遗传距离为3.06 c M,物理距离为238 444 bp,可解释41.95%的表型变异。生物信息学分析表明在候选区段内包含有17个候选基因,其中Cucsa.275630为TIR-NBS-LRR类基因。【结论】本研究将黄瓜白粉病抗性基因精细定位到约238 kb的候选区段内,区段内包含有一个TIR-NBS-LRR基因,该基因将是今后研究的重点候选基因。

印度南瓜果皮和果肉颜色遗传分析及基因定位

以印度南瓜‘98-2-351’与‘06820-1’杂交构建F2群体,对亲本及各世代群体成熟果实果皮和果肉颜色进行调查、统计分析。结果表明:F2群体中果皮桔红色和灰色的分离比呈3∶1,说明果皮灰色是由单隐性基因控制;F2群体中果肉黄色和白色的分离比呈3∶1,说明果肉白色也是由单隐性基因控制。利用群体分离分析法结合隐性群体分析法,采用SSR分子标记,找到了2个与控制灰色果皮基因位点CmRc紧密连锁的SSR标记(PU078072和PU013839),其连锁遗传距离分别为5.9cM和14.5cM;同时找到了1个与控制白色果肉基因位点CmFc紧密连锁的SSR标记PU132712,其连锁遗传距离为6.7cM。本研究为进一步筛选与控制印度南瓜果皮和果肉颜色基因更加紧密连锁的分子标记及相关基因的精确定位奠定了基础。

源宝占抗稻瘟病遗传分析及基因定位

稻瘟病是水稻三大病害之一,严重威胁着粮食安全。解决这一问题最安全、有效的措施是选育、推广抗病品种。源宝占是一份新育水稻材料,经鉴定,源宝占对来自广东各稻作区的25个菌株中23个表现为抗性,抗频达92%,为广谱抗性材料。以源宝占与粤香占进行杂交,构建F1、F2群体,选用GD00-193a菌株对亲本及世代群体进行接种鉴定,结果表明F2代单株抗感分离比符合3∶1,这说明源宝占对菌株GD00-193a的抗性是由一对显性基因或一个主效QTL控制。利用群体分离分析法(BSA)结合隐性群体分析法(RCA)将此基因定位于标记RM136与RM549之间。

四倍体小麦成株抗白粉病基因定位

四倍体小麦是普通小麦的祖先种,也是重要的粮食作物。发掘四倍体小麦抗病种质并鉴定其携带的抗病基因,旨在为小麦新品种选育提供新抗源。TDI-1是栽培二粒小麦,在多年的田间种植过程中表现出对白粉病免疫的表型。为了确定TDI-1携带的抗病基因,为小麦白粉病抗性遗传提供理论依据,首先将其与表现为感白粉病表型的硬粒小麦TDU-1进行杂交并构建了遗传群体,然后对亲本及其杂交F_(1)、F_(2)、F_(2:3)群体进行了白粉菌小种E09接种试验和抗病性分析,最后利用混合分离群体分析法(BSA)对抗白粉病基因进行了定位。结果表明,TDI-1在苗期对E09表现为感病,在成株期对E09表现为抗病;TDI-1和TDU-1的F_(1)植株在成株期对E09表现为抗病;F_(2)群体中,表现为抗病的单株数和感病的单株数的比例符合3∶1(χ^(2)_(3∶1)=0.11,P=0.74);F_(2∶3)家系中,纯合抗病、抗病性分离、纯合感病的家系数目之比符合1∶2∶1(χ^(2)_(1∶2∶1)=0.47,P=0.79),表明TDI-1成株期白粉病抗性由1个显性基因控制,暂将其命名为PmTDI-1。对TDI-1和TDU-1及其杂交后代F_(2)群体进行分子标记筛选,发现4个位于2A染色体短臂上的分子标记Xwmc407、NRM-2AS29、NRM-2AS45和NRM-2AS84与PmTDI-1紧密连锁,其中,NRM-2AS45和NRM-2AS84位于两侧,遗传距离分别为1.8,4.6 cM。由此,将成株期抗白粉病基因PmTDI-1初步定位于2A染色体短臂上。研究结果显示,从四倍体小麦TDI-1中鉴定到1个新的显性成株抗白粉病基因PmTDI-1。

一个萝卜绿皮新基因GST1的遗传定位

为深入理解萝卜皮色形成机制,开发萝卜皮色标记进行辅助育种,本研究利用绿皮萝卜G-2和白皮萝卜W-1构建了遗传群体,明确了绿皮表型的遗传规律;结合混合分离群体分析和RNA-Seq技术(BSA-seq)确定了绿皮调控位点所在染色体,接着开发分子标记定位了绿皮基因。结果显示,G-2和W-1的F_(1)代植株肉质根表现为介于亲本之间的中间色(浅绿色),其F_(2)代群体单株分离出绿色、中间色和白色肉质根,大致符合1∶2∶1的分离比例(χ^(2)=3.21,P>0.05),表明绿皮表型在遗传后代中呈不完全显性,并由1个主效基因控制,暂将其命名为Green-Skinned Taproot 1(GST1)。BSA-Seq结果显示,有1827个萝卜单核苷酸多态性(SNP)位点在G-2×W-1 F_(2)代群体绿皮池和白皮池间具有多态性,其中31.86%位于R01染色体,并且主要分布在短臂端部0~5 Mb的物理区间内。在此区段附近开发分子标记,最终将GST1定位到标记sxau30和sxau34之间,遗传距离分别为6.4和8.3 cM,对应萝卜品种Radicula参考基因组R01:2.93~8.99 Mb的物理区间。此区间共有210个高置信注释基因可在肉质根表皮中表达,其中有44个在绿皮池和白皮池之间表达差异显著,对可能参与叶绿素合成或代谢途径的4个候选基因进行了实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证,其表达水平与BSA-Seq结果一致。本研究结果为萝卜绿皮成色机制解析奠定了理论基础,也为皮色分子育种提供了新标记。

利用东乡普通野生稻染色体片段置换系定位水稻苗期耐盐性QTL

本实验室前期以东乡普通野生稻和日本晴为亲本创制了强耐盐染色体片段置换系CSSL91,本研究将其与日本晴和强耐盐种质Pokkati比较,结果显示CSSL91耐盐性与Pokkali相当。以CSSL91与日本晴构建的F2:3群体为试验材料,日本晴和CSSL91为对照,以耐盐等级和幼苗存活率为指标。结果表明2个指标均成正态分布,QTL连锁定位分析共检测到5个耐盐相关QTL,分别分布于第4、9、10号染色体上,LOD值介于2.95~3.97,表型贡献率为9.83%~18.48%;其中耐盐等级QTL-q ST4的表型贡献率最高,其定位在第4号染色体DX-C4-1~DX-S4-16标记间。分离群体分组分析法(BSA,bulked segregation analysis)分析检测到第4号染色体0~5.0 Mb区间有一个超过阈值的QTL,该区间与QTL-q ST4重合,QTL连锁分析方法和BSA方法均在第4号染色体的0~5.0 Mb区间定位到耐盐等级QTL,说明QTL-qST4是可靠的耐盐位点;耐盐等级QTL-qST4-1和幼苗存活率QTLqSSR4均定位在第4号染色体DX-C4-12和DX-C4-13标记间,LOD值分别为3.36和3.92,表型贡献率分别为13.97%和9.49%;在第9号、10号染色体还定位到两个耐盐等级QTL-qST9和QTL-qST10;其中QTL-qST4-1、QTL-qSSR4和QTL-qST10是本研究新定位的耐盐性QTL。本研究结果将为水稻耐盐性相关基因克隆和分子标记辅助改良水稻品种的耐盐性奠定基础。

大白菜中与芜菁花叶病毒(TuMV)感病基因连锁的AFLP标记

TuMV是大白菜病毒病的主要病原物之一,所以抗TuMV病毒病成为白菜抗病育种的主要目标,寻找与抗性基因紧密连锁的分子标记,进行分子标记辅助育种,是提高白菜抗病育种效率的有效手段。以抗病自交系Brp0058和感病自交系Brp0181杂交后代的F2分离群体为试材,采用分离群体分组分析法(BSA),筛选到2个与TuMV感病基因紧密连锁的AFLP分子标记,利用MAPMAKER/EXP(Version3.0)作图软件统计,其遗传距离分别为7.5和8.4cM。

甘蓝型油菜种皮色泽相关基因的cDNA-SRAP差异显示

为探寻甘蓝型油菜黄黑籽之间的种皮色泽表达差异的分子基础,探索cDNA-SRAP差异显示的可行性,选用培育7年的重组自交系群体(RILs),根据群体分离分析法(bulkedsegregantanalysis,BSA)构建了种子的RNA混合池,利用cDNA-SRAP法进行了差异显示研究。996对SRAP引物组合扩增出2100条带,2次扩增重复率为65.2%,其中在黄黑籽材料之间重复稳定出现的差异片段有12条,长度在100～300bp之间。选择其中7条差异片段,进行回收、克隆和测序,发现2个片段分别与拟南芥的NAD+ADP核糖转移酶及小肽转移蛋白3具有很高的同源性。结果表明,利用SRAP方法可以对甘蓝型油菜cDNA混合池进行差异显示研究,2条差异片段可能与甘蓝型油菜的种皮色泽基因表达相关。

利用分子标记定位普通菜豆抗炭疽病基因

为了定位中国普通菜豆的抗炭疽病基因,选取抗炭疽病地方品种红芸豆(国家库编号F2322)与高感菜豆品种京豆(国家库编号F0777)配制杂交组合,构建F2抗感分离群体和F2:3家系,用菜豆炭疽菌81号生理小种鉴定抗病性并分析遗传性。结果表明,红芸豆对菜豆炭疽菌81号小种的抗性是由一显性单基因控制的,暂将该基因命名为Co-F2322。用分离群体分组分析法(BSA)和SSR、CAPs分子标记技术,将该基因定位在B1连锁群上,利用软件Mapmaker 3.0和Mapchart 3.0计算标记与目的基因间的遗传距离,检测到3个SSR标记BMc32、C871、Pvm98和2个CAPs标记g1224、g683与抗炭疽病基因连锁,遗传距离分别为26.06、3.58、13.56、3.81和12.75cM。

大白菜抗芜菁花叶病毒基因EST-PCR-RFLP分子标记的研究

本试验以高抗芜菁花叶病毒C3株系(TuMV-C3)的高代自交系A156-2和感病自交系P9805杂交后代的F2代为群体,根据大白菜的抗性相关的表达序列标签(EST)设计引物,利用分离群体分群分析法(BSA),筛选出2个与TuMV-C3株系抗病基因紧密连锁的EST-PCR-RFLP分子标记BS300及BS160,遗传距离均为6.5 cM,为大白菜分子辅助育种、抗病基因克隆以及研究抗病基因编码特性等奠定基础。

利用BSA法检测水稻条纹叶枯病高效应抗性位点

通过前期对江苏水稻地方品种抗条纹叶枯病资源的筛选获得的一份高抗条纹叶枯病水稻品种旱稻,配制其与条纹叶枯病感病品种武育粳3号杂交组合,采用田间自然接种鉴定方法,以病情指数为表型值,对141个F2单株的F2:3株系进行了条纹叶枯病抗性鉴定。同时利用群体分离分析法(Bulked segregant analysis,BSA法)对抗/感DNA池分析发现第11染色体SSR标记RM209、RM21与条纹叶枯病抗性有明显的连锁关系。利用基于完备复合区间作图方法的QTL检测软件(QTL IciMapping V3.2)在第11染色体上检测到一个条纹叶枯病抗性相关QTL,位于SSR标记RM209和RM21之间,LOD值为13.25,可解释表型变异38.39%,加性效应为负值,表明该数量性状基因座对水稻条纹叶枯病的抗性来自抗病亲本旱稻。

甘薯根腐病相关AFLP标记筛选

甘薯根腐病是由甘薯根腐病病原菌[Fusarium solani(Mart.)Sacc.f.sp.batatas McClure,简称FSB]引起的一种真菌性毁灭性病害,传播途径广,蔓延速度快,近年有向长江流域以南地区传播的趋势,对甘薯生产造成极大危害。在已有的徐薯18与胜利百号F1分离群体抗性鉴定的基础上,采用分离群体混合分析法(Bulked segregant analysis,BSA)与AFLP技术相结合,通过筛选80对引物,定位与甘薯根腐病相关的分子标记,在感病群体中定位到一个显性标记,即标记Eco(45)-Mse(45)被发现与感病基因连锁。所获试验结果对甘薯抗病遗传改良具有指导意义。

基于BSA-seq技术挖掘糙皮侧耳抗螨候选基因

根据前期不同糙皮侧耳菌株抗螨性差异调查结果,构建了糙皮侧耳孢子单核体群体,群体内479个菌株抗螨性呈正态分布。利用BSA-seq技术对高抗和高感混池进行SNP和InDel位点的欧氏距离关联分析,将抗螨性候选基因定位到一条染色体上,2个相邻候选区域总长度为1.75 Mb,内有基因605个,其中非同义突变基因353个,移码突变基因89个。经功能注释以及GO和KEGG通路富集等分析,发现26个候选基因参与了信号传导、防御过程和次级代谢相关通路,推测这些候选基因可能与糙皮侧耳抗螨性相关。

双孢蘑菇性亲和性相关分子标记的初步筛选

以传统的形态 ,生理生化分析和最新的DCS -PDMA性亲和性测定方法为基础 ,结合群体分离分析和RAPD技术对来源于同一双孢蘑菇异核体菌株的 12个不育同核原生质体个体进行分析 ,筛选与性亲和性相关的分子标记。研究结果表明 ,供试的 12个不育同核原生质体个体被分成两大类性亲和性类型 ,其中一类 (A+ )包括不育同核原生质体个体B、C、D、E、F、G、H、I、J、L ,另一类 (A-)则仅仅包括不育同核原生质体个体K和M ,同时筛选到一个与性亲和性相关的分子标记OPA16 150 0 。从而为间接地利用双孢蘑菇本身特有的交配型作标记来指导杂交育种工作和进一步将其性亲和性基因定位分离克隆奠定了坚实的基础。

有丝分裂雌核发育牙鲆不育的组织学观察及微卫星标记筛选

在有丝分裂雌核发育牙鲆（Paralichthys olivaceus）中出现数量较多的不育个体,利用组织切片观察比较不育牙鲆的组织学特点,利用分离群体分组分析法筛选不育相关的微卫星标记.结果表明：不育牙鲆的性腺指数为3.77％～4.17％,显著小于可育牙鲆（P＜0.05）.不育牙鲆的卵巢微血管较少,卵巢膜呈现白色,卵巢较硬,没有游离卵粒;切片结果显示,其卵巢处于Ⅲ期.通过对209个微卫星标记的筛选,共找到11个在可育和不育群体间有差异的标记;利用同一家系可育和不育的个体进行验证后发现,位于15号连锁群的4个标记与牙鲆的育性紧密相关.

棉花籽指数量性状位点(QTL)的初步定位

为挖掘棉花籽指相关的分子标记,以棉花籽指差异较大的陶小铃和大桃棉为亲本,构建F2群体,对F_(2)群体的籽指进行调查,选取具有极端籽指的植株构建混合群体分离分析(bulked segregant analysis,BSA)混池进行测序。对测序结果进行分析,发现3个与棉花籽指相关的区域,分别位于A07染色体42.6~91.6 Mbp,A13染色体2.2~5.3 Mbp,D10染色体7.1~8.3 Mbp。3个区域的Δ(SNP-index)峰值区段共包含142个候选基因。这些结果为棉花籽指相关基因的精细定位和克隆奠定了基础。

用于拟南芥染色体着陆的一套InDel标记的设计与应用

在拟南芥图位克隆中SSLP(simple sequence length polymorphism)是首选分子标记,当无可用SSLP时才会考虑CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)、d CAPS(designed CAPS)及SNAP(single nucleotide amplified polymorphism)等标记。图位克隆的第1步就是染色体着陆,需逐个检测覆盖全基因组的标记,工作繁琐,更加依赖操作相对简单的SSLP标记。但是,SSLP标记在染色体上分布不均,有些标记缺乏物理位置记录,而且很多标记的PCR反应体系和扩增条件不同,这些瑕疵增加了染色体着陆乃至图位克隆其他步骤的工作量,有碍图位克隆的顺利开展。针对上述不足,以InDel多态性位点为基础设计一组标记,专门用于染色体着陆,以弥补现有SSLP标记的不足。这套标记有确切的物理位置,每个标记所控制的染色体区间小于30 cM,而且这套标记可采用相同的PCR反应体系和反应程序。随即用这套标记成功地实现了6个Ler背景的隐性突变体的染色体着陆,显示这组标记能够满足实验要求,使得拟南芥图位克隆得到简化。

甜玉米小斑病抗性的遗传分析与主效QTL定位

为培育抗病品种,利用抗小斑病甜玉米自交系T14和感小斑病自交系T18为亲本配制杂交组合,对玉米抗小斑病性状进行遗传分析和抗病基因分子标记定位,用主基因+多基因混合遗传模型和P1、P2、F1、B1、B2、F26世代联合分析的方法对单位叶面积病斑数量进行遗传分析,并应用复合区间作图法检测抗小斑病QTL。结果表明,单位叶面积病斑数量受2对加性-显性-上位性主基因控制,自交系T14的抗病性在各个分离世代都以主基因遗传为主。在第4染色体上检测到4个相互连锁的小斑病抗性QTL,解释表型变异的7.7%、30.9%、14.8%和11.5%;在第6染色体上定位了1个抗病QTL,可解释表型变异的37.7%。检测到的小斑病抗性主效QTL位于第4和第6染色体的特征与2对主基因的遗传模型相吻合。