分裂泛素化酵母双杂交系统研究光合膜蛋白相互作用

光合类囊体膜主要由光系统Ⅱ、细胞色素b6f复合物、光系统Ⅰ以及ATP合酶4个超分子复合物组成.利用分裂泛素化酵母双杂交系统研究光合类囊体膜蛋白间的相互作用.将叶绿体psbA基因编码的D1蛋白作为诱饵蛋白,以叶绿体基因psbD编码的D2蛋白、petB编码的Cytb6蛋白作为靶蛋白,分别共转化酵母菌株后进行相互作用分析.实验结果表明,诱饵蛋白D1能与来源于同一复合物光系统Ⅱ的D2蛋白发生相互作用,而与来源于细胞色素b6f复合物的Cytb6蛋白没有互作.这一结果表明,分裂泛素化酵母双杂交系统可以用于检测光合膜蛋白间的相互作用,从而为研究光合膜蛋白生物发生的调控机理提供一个有效的工具.

分裂泛素化酵母双杂交系统研究信息素因子STE2蛋白相互作用

真菌的进化、分化及有性发育趋势受若干性别基因的调控,如交配型、信息素因子及异源三聚体G-蛋白ɑ-亚基基因等;同时,信息素因子调控真菌的有性生殖在酿酒酵母中也得到充分研究。匍柄霉属(Stemphylium)是丝状子囊真菌中的一类重要真菌类群,许多丝状子囊真菌属、种中含有信息素因子。在自然界中,匍柄霉属真菌大多数是以无性态的形式存在,但其中也有一小部分存在有性生殖阶段。为了深入研究信息素受体STE2及其相关基因对匍柄霉属典型种有性生殖的影响,本研究选取含有信息素因子STE2的匍柄霉属典型种Stemphylium eturmiunum为试验材料,克隆鉴定了信息素受体STE2,然后将其构建至诱饵蛋白表达载体上,并在cDNA文库初筛得到数个疑似互作蛋白片段基础上,克隆其基因全长构建至靶蛋白表达载体上,并利用分裂泛素化的膜酵母双杂交系统,进行一对一验证筛选STE2的相关互作蛋白。该研究筛选出的互作蛋白结果为后期的CO-IP、Poll-Down实验提供了基础。

基于酵母双杂交文库鉴定鸡PGCs形成过程中的关键泛素化修饰酶

试验拟筛选与C2EIP互作的蛋白,构建调节PGCs形成过程的泛素化E3连接酶复合体。通过逆转录和同源重组等方法构建鸡PGCs酵母文库;将C2EIP连入诱饵空载体pGBKT7中,并转化酵母感受态细胞进行诱饵载体(C2EIP-pGBKT7)的毒性和自激活检测;将酵母文库与诱饵载体菌液共培养后,通过涂板筛选阳性克隆并进行测序和生物信息学分析筛选互作蛋白。结果显示:成功构建了鸡PGCs酵母文库,其滴度为3.0×10^(6)cfu/mL,总库容为1.5×10^(7)cfu,且重组率为100%,符合筛库要求。成功构建无毒性和不能自激活的C2EIP-pGBKT7诱饵载体,能够用于后续的文库筛选。C2EIP-pGBKT7诱饵载体菌液与酵母文库共培养后,通过PCR测序与蛋白序列分析后共筛选了36个C2EIP的互作蛋白,其中RCJMBM04和CCDC174蛋白功能域分析发现分别具有典型的RING功能域和PPXY基序,进行的生物信息学分析发现WWP1和WWP2具有典型的WW功能域,能够与CCDC174结合。研究表明,试验成功鉴定了C2EIP/RCJMB04/CCDC174/WWP泛素化E3连接酶复合体,为后续研究泛素化修饰调控鸡PGCs形成机制奠定理论基础。

用酵母双杂交系统筛选泛素/核糖体蛋白S27a

背景与目的:蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,在细胞增殖和分化、信号的传导和加工等方面起重要作用。CK2在多种白血病细胞中的活性比相应的正常组织高2～8倍,且CK2的变化与肿瘤的生长情况相关。为研究其在白血病细胞中的作用机制,本研究拟利用酵母双杂交系统从自行构建的HL鄄60细胞cDNA文库中筛选出与蛋白激酶CK2α'亚基相互作用的蛋白。方法:通过PCR扩增已构建成功的重组质粒pTHCK2A',获得人CK2α'亚基编码区cDNA;将PstⅠ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7,构建酵母双杂交穿梭表达质粒(BD质粒),经DNA测序确证及转染感受态酵母菌AH109以排除自主激活。从体外培养的HL鄄60细胞中提取总RNA,以酵母穿梭表达质粒pGADT7鄄Rec为载体,采用CLONTECHSMART(switchingmechanismat5'endofRNAtranscript)技术,在酵母细胞中构建HL鄄60细胞的酵母双杂交cDNA文库,文库质粒为AD质粒。将上述构建成功的BD质粒、AD质粒共转染感受态酵母菌AH109,进行酵母双杂交实验。以筛选真阳性克隆(即与人蛋白激酶CK2α'相互作用的蛋白)。结果:经过酵母双杂交实验,筛选出6种与蛋白激酶CK2α'相互作用蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,其中1个与泛素/核糖体蛋白S27a有高度?

酵母双杂交泛素系统分析CLV1/2/3间的相互作用

CLAVATA(CLV)家族在拟南芥茎顶端分生区干细胞增殖与分化平衡的调节中发挥至关重要的作用.CLV基因家族编码受体蛋白激酶CLV1、受体样蛋白CLV2和细胞外多肽信号配基CLV3,前期研究表明,CLV1和CLV2可能以复合体形式接收并向胞内传递CLV3的信号,而受体激酶CORYNE(CRN)参与CLV3信号转导途径,可能和CLV2相互作用组成二聚体与CLV1形成平行独立的通路来应答CLV3信号.采用酵母双杂交泛素分裂系统研究了CLV家族蛋白之间的相互作用,研究结果表明CLV1的胞外域与CLV3和CLV2分别存在相互作用,这进一步为CLV家族受体-配体复合体的形成提供了证据.

分离的泛素系统——一种新型的膜蛋白酵母双杂交系统

酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的重要遗传学方法之一,然而传统的酵母双杂交 技术在实际应用中存在着一定的局限性。分离的泛素系统(split-ubiquitin system)作为一种新型的不依 赖转录激活机制的酵母双杂交系统,原理是通过待检测蛋白质之间的相互作用将突变的、分离的泛素 分子N端和C端部分融合,通过泛素专一的蛋白酶UBP的识别使报告蛋白解离人核,激活报告基因表 达。该系统被研究的蛋白质间的相互作用不在局限于核内,更适合于发生在胞膜或胞质中的相互作用 研究,是一种非常值得推广的遗传学方法。

利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC互作蛋白质

TaSC(Triticum asetivum L.salt-tolerance related gene,Gen Bank登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。以该基因编码的蛋白质TaSC为诱饵,运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA表达文库中钓取互作蛋白质,筛选到一个编码小麦未知功能蛋白质的基因(GenBank登录号为AK336035),命名为TaSCIP1(TaSC interaction protein 1)。双分子荧光互补(BiFC)实验证实TaSCIP1与TaSC存在互作。该互作蛋白的分离有利于进一步研究TaSC基因的耐盐机制。

利用酵母双杂交系统筛选花生AhCaM相互作用蛋白

CaM是目前已知的胞内Ca2+受体蛋白中最重要的一种,参与多种生理活动的调节。为深入研究CaM蛋白的作用机制,探索其在花生钙信号途径中的作用靶点,用花生CaM基因构建了既无自激活性又无毒性的p GBKT7-AhCaM诱饵表达载体;同时从花生叶片组织中提取总RNA,分离得到mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA后建立花生叶片cDNA文库;通过共转化法筛选与CaM相互作用的蛋白,并对阳性克隆分析和鉴定,筛选到5个与Ah CaM互作的蛋白,其中NAD激酶是已知能与钙调素互作的蛋白;而泛素能与AhCaM互作,说明AhCaM在花生发育及抗逆方面起作用。通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究AhCaM的未知生物学功能提供了重要信息。

酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白--泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因(UBA52)的cDNA序列有高度同源性(100%).GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用.本实验证明,人泛素-52氨基酸(UBA52)融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白,它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中.

利用双杂交系统对SeNPV泛素与抗细胞凋亡蛋白相互作用的研究

本文报道利用酵母双杂交系统研究甜菜夜蛾核多角体病毒(SeNPV)的泛素(Ubiqutin)与抗细胞凋亡蛋白(IAP2,IAP3)相互作用的结果。使用Clontech公司的MACHMAKERGAL4Two-hybridsystem3,以病毒ubiquitin基因与酵母GAL4的DNA结合域重组表达“诱饵”蛋白,以病毒iap2或iap3基因与DNA活化域重组表达“猎物”蛋白,在低严谨型筛选培养基上均得到阳性克隆。这一结果表明,甜菜夜蛾核多角体病毒泛素与IAP2或IAP3在体外能进行相互作用,这种作用利用了酵母内源性E1和E2。SeNPV的抗细胞凋亡蛋白(IAPs)可能是泛素-蛋白酶水解途径(UPP)中的泛素连接酶(E3),或者是泛素依赖性蛋白水解酶的靶底物。

应用酵母双杂交系统筛选LKB1相互作用蛋白

目的应用酵母双杂交技术研究与抑癌基因LKB1发生相互作用的蛋白。方法应用酵母双杂交系统,以人LKB1为诱饵,筛选人类全基因组开放阅读框酵母双杂交文库,寻找能与之相互作用的蛋白,并且通过免疫共沉淀和GST-Pull down实验证实其之间的相互作用。结果经过酵母双杂交共获得17个克隆,经过验证分析,最终确定1个无重复阳性克隆。结论获得的1个基因编码的蛋白可能揭示LKB1新的作用机制。

大豆膜系统cDNA文库的构建及大豆疫霉效应子PsAvr3a互作蛋白的筛选

植物质膜是响应侵染的第一道屏障,其受体蛋白是感知病原菌入侵的雷达,是植物免疫系统的重要组成部分。大豆疫霉(Phytophthora sojae)通过分泌效应子干扰寄主免疫反应以促进自身侵染定殖。构建大豆膜系统酵母双杂交cDNA文库,为进一步探究大豆疫霉效应子与寄主膜蛋白靶标互作机制奠定基础。以大豆疫霉无毒效应子PsAvr3a为诱饵蛋白筛选文库,初步获得198个候选寄主靶标。酵母一对一验证试验表明,有5个候选靶标蛋白与PsAvr3a互作,包括酪氨酸分解酶、囊泡转运蛋白、乙烯合成调控酶、细胞代谢结合蛋白、抗逆的渗透蛋白等。通过双分子荧光互补试验(bimolecular fluorescence complementation, BIFC)与荧光素酶互补试验(luciferase complementation assay, LCA)验证得出GmACO、GmSec61与PsAvr3a均存在互作。确定2个寄主大豆膜蛋白乙烯前体ACC氧化酶GmACO、三聚体易位子GmSec61是大豆疫霉无毒效应子PsAvr3a的互作靶标。

利用酵母双杂交系统研究桑脉带相关病毒核外壳蛋白自身相互作用

桑脉带相关病毒(mulberry vein banding-associated virus,Mu VBa V)属布尼安病毒科番茄斑萎病毒属,是广西桑树病毒病的主要病原。为研究其核外壳蛋白(nucleocapsid protein,N)的自身相互作用,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统构建了N蛋白的诱饵表达质粒和猎物表达质粒并转化酵母菌株NMY51。诱饵表达质粒p BT3-SUC-Mu VBa V-N或p DHB1-Mu VBa V-N和阳性对照质粒p Ost1-Nub I共转化的酵母菌在筛选性营养缺陷型培养基上SD-trp-leu-his-ade(SD-AHLW)均能正常生长,而与阴性对照质粒p PR3-N共转化的酵母在营养缺陷型SD-AHLW平板上不能正常生长,表明N蛋白诱饵质粒的表达产物没有自我激活活性,对酵母细胞也没有毒性。N蛋白诱饵表达质粒及其猎物表达质粒共转化的酵母也可以在SD-AHLW培养基上正常生长,说明N蛋白在酵母细胞中可发生自我相互作用。本研究结果为今后研究Mu VBa V N蛋白的功能以及通过筛选桑c DNA文库获得互作寄主因子奠定了良好的基础。

番茄分裂泛素酵母双杂膜系统cDNA文库及SlToc159诱饵载体的构建

叶绿体是植物进行光合作用、脂质代谢以及氨基酸合成的重要场所。叶绿体自身基因组编码的蛋白质仅有100个左右,其余95%(约3000多个)的叶绿体蛋白质即前体蛋白是由细胞核基因组编码的,在细胞质中翻译后通过TOC-TIC转运蛋白复合体导入叶绿体的特定位置而发挥生物学功能。Toc159是叶绿体外膜转运蛋白,主要负责转运初始阶段前体蛋白的特异性识别。为研究番茄SlToc159与前体蛋白的互作机制,本试验以‘Alisa Craig’番茄为材料,提取番茄幼苗叶片总RNA,采用Gateway技术构建分裂泛素化膜系统cDNA文库,同时构建诱饵载体pBT3-N-Toc159AGM和pBT3-N-Toc159GM,并用营养缺陷法检测其自激活活性。文库质量检测结果显示,文库总容量为1.6×10^(7)CFU,文库滴度为4.0×10^(6)CFU·mL^(-1),外源基因插入片段为750~2000 bp,重组率为100%,符合后续筛选互作蛋白的cDNA文库要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pBT3-N-Toc159AGM和短截A区的pBT3-N-Toc159GM构建成功,能够在分裂泛素化系统中正确表达且无自激活活性。本研究结果为番茄膜蛋白利用酵母双杂交筛选互作蛋白提供参考与理论基础。

NS5A-TP5蛋白结合蛋白1的基因克隆化研究

目的 :应用酵母双杂交技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆NS5A TP5蛋白结合蛋白基因1(NBP1)。方法 :应用酵母双杂交系统 3 ,构建NS5A TP5诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y 187进行配合 ,于涂有x α gal营养缺陷型培养基 (SD/Trp Leu His Ade)上筛选生长。 结果 :挑选蓝色克隆 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序 ,然后进行生物信息学分析 ,新基因的开放读码框架长度为 2 40个核苷酸 (nt) ,编码产物由 79个氨基酸残基 (aa)组成 ,命名为NBP1,GenBank注册号为AY 45 92 91。结论 :NBP1的筛选与克隆 ,可为进一步研究HCVNS5A

ABIN蛋白家族结合泛素链与A20参与调控NF-κB的影响与意义

1 ABIN概述ABIN蛋白家族包含ABIN1、ABIN2、ABIN3三种蛋白,这三种蛋白都显示出有限的序列同源性：含有同源区域AHD1和泛素交联区域UBAN（图1）。AHD1可介导ABIN蛋白与A20相结合,UBAN可介导ABIN与泛素相交联,通过ABIN结合泛素、A20编辑泛素的方式来抑制NF-κB的活化,这体现出了ABIN蛋白家族的同一性。

RNA内切酶CPSF3受E3D泛素连接酶UBE3D调控

泛素化是泛素分子在系列特殊酶作用下,对靶蛋白进行特异性修饰的过程,该过程参与细胞周期、基因表达、信号传递等几乎一切生命活动的调控,近年来成为开发新药物的新靶点。泛素化研究中,确定E3泛素连接酶和其特异性底物之间的作用是研究的重点和难点,探索底物蛋白翻译后修饰命运,对于研究E3泛素酶的修饰类型具有指示性的作用。E3D泛素连接酶基因(UBE3D)在人和小鼠中相对保守,小鼠中UBE3D纯合敲除致死,提示UBE3D在胚胎发育过程中具有重要作用。本文选用了酵母双杂交(Y2H)、亲和纯化质谱(AP-MS)及免疫共沉淀(Co-IP)3种方法,筛选出了UBE3D的候选底物切割与聚腺苷酸化因子3(CPSF3).研究中发现,过表达UBE3D可以显著上调CPSF3的蛋白表达水平,敲低UBE3D可以显著下调CPSF3蛋白的表达水平,揭示UBE3D具有稳定CPSF3的作用。细胞外源泛素化实验表明,过表达UBE3D不会改变CPSF3的蛋白泛素化水平,提示UBE3D对CPSF3的泛素化修饰可能不同于常规E3泛素连接酶。CPSF3是一种核酸内切酶,对于mRNA的成熟和基因表达至关重要。因此,UBE3D可能通过稳定CPSF3对胚胎发育起到重要作用。

水稻酵母双杂交文库构建及PID2胞内结构域互作蛋白的筛选

为了进一步挖掘水稻PID2胞内互作蛋白质,阐明Pid2介导的稻瘟病抗性机制。本研究利用SMART技术,构建了受稻瘟病诱导后不同时间段的含抗性基因Pid2水稻材料的cDNA文库;通过PCR扩增获得PID2胞内结构域编码片段Pid2-JM,构建了诱饵表达载体pGBK-Pid2-JM,并进一步利用酵母双杂交技术筛选Pid2-JM的互作蛋白。结果表明,构建的cDNA酵母文库细胞密度为9.0×10;Cells/mL,文库插入片段在500~2000 bp之间,重组率为100%,诱饵载体无自激活活性;利用诱饵载体经筛选文库后,新发现一个能与Pid2-JM互作的U-box类E3泛素连接酶PBP1,经回转试验验证了PBP1与Pid2-JM可在烟草细胞内互作。综上,本研究成功构建了稻瘟病诱导下的水稻酵母双杂交文库,并筛选到一个能与PID2胞内结构域互作的U-box类E3泛素连接酶,该结果为进一步揭示水稻抗稻瘟病信号转导机制提供参考。

神经病靶标酯酶调控结构域结合蛋白筛选及其在COS-7细胞中的表达

本研究采用酵母双杂交系统探寻与神经病靶标酯酶(NTE)调控结构域相互作用的蛋白因子,揭示与NTE信号转导相关的可能机制。通过构建含有NTE调控结构域的诱饵蛋白载体筛选胎脑文库,并将筛选得到的阳性克隆在酵母中进行了验证,随后在哺乳动物细胞中表达了该蛋白。生物信息学分析显示:该阳性克隆为前列腺素受体结合蛋白54(ARA54),具有泛素连接酶活性,提示细胞可能存在依赖于细胞周期的NTE活性调节机制,为阐明NTE生理功能创造了条件[动物学报51(5):840-844,2005]。

植物蛋白相互作用的研究方法

蛋白的相互作用是生命科学研究中的一个重要领域,对于研究未知蛋白的功能与作用具有重要意义,是目前研究的热点领域。文章介绍了非目标蛋白及目标蛋白相互作用的研究方法,讨论了这些研究方法在植物蛋白相互作用上的应用,并展望了研究蛋白相互作用的前景。