FACSAria Ⅱ分选人肺腺癌A549细胞SP亚群的方法优化

目的·通过优化流式分选人肺癌A549细胞SP亚群方法,提高SP亚群分选纯度并缩短分选时间,以提高分选活率。方法·制备单细胞悬液,不同终浓度维拉帕米孵育及Hoechst33342标记染色,经PI标记检测SP细胞比例。选择最佳染色浓度,100μm喷嘴,分选速度10μL/min,用一次分选法（纯度模式）和二次分选法（富集＋纯度模式）分选SP细胞和MP细胞,比较分选后纯度和分选用时。通过二次分选法获得SP细胞和MP细胞,分别行Lyso-Tracker Red/Hoechst 33342染色共聚焦观察和成瘤实验。结果·经二次分选法,SP细胞纯度达到99%以上,1×10～8个细胞分选时间〈5.2 h。共聚焦镜下观察到SP细胞大小与MP细胞无明显差异,MP细胞的溶酶体数量较SP细胞显著增多。Hoechst 33342均能染色,细胞活率不受影响。在小鼠成瘤实验中,SP细胞成瘤体积较MP细胞显著增大。结论·A549肺癌细胞Hoechst33342染色终质量浓度宜用6μg/mL;采用FACSAriaⅡ对其SP细胞进行二次分选,不仅显著提高SP细胞分选纯度,还大大缩短分选时间,细胞活率不受影响。

高纯度激光流式分选的参数选择

对ＦＡＣＳ＾ＰＬＵＳ ｔａｒ分选仪上超声振动频率、振动驱动振幅、鞘流压力、样品流动速率和分选窗等对分选结果的影响进行了研究。实验表明，在振动频率为２７．４８４ｋＨｚ，振动驱动振幅为４．８～５．０Ｖ，鞘流压力为６８．９～７２．３ｋＰａ时，能获得长时间稳定的液滴成形和偏转；在样品检测速率大于２５００个／ｓ时，分选纯度和回收率均有明显下降；样品中欲分选亚群所占百分比大于３０％时，分选纯度可达９９％以上。