G蛋白偶联受体相关分选蛋白功能特征与相关疾病研究进展

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)作为最大的一类膜蛋白受体家族,可被多种配体激活并发挥相应的信号转导功能,参与生物体内重要的生理过程。G蛋白偶联受体相关分选蛋白(G protein-coupled receptors associated sorting proteins,GASPs)则对内吞后的GPCRs分选过程发挥着重要的作用,并介导受体进入降解或再循环途径,进而调控细胞的信号转导等过程。研究发现GASPs的功能缺陷与多种疾病相关,包括神经系统疾病、肿瘤和耳聋等。本文重点介绍了G蛋白偶联受体相关分选蛋白的功能特征及其相关信号通路,描述了GASPs功能缺陷与疾病的关联性及家族蛋白与GPCRs的相互作用、GASPs分选途径的发现、参与的信号通路及对基因转录调控,以期为GASPs相关多种疾病的治疗提供新的思路和策略。

G蛋白偶联受体相关分选蛋白研究进展

G 蛋白偶联受体（G Protein-coupled Receptors,GPCRs）是人类基因组编码的最丰富的一类膜蛋白家族.GPCRs 可被包括气体、光子、氨基酸及其衍生物、Ca2 ＋ 、肽、脂类物质和大量的糖蛋白激素等在内的多种配体激活,进而引发细胞信号转导,参与调节人体心血管系统、免疫系统和神经系统等在内的几乎所有的生理过程.

推拿对失神经骨骼肌萎缩大鼠自噬相关因子Beclin-1、液泡分选蛋白34和微管相关蛋白轻链3的mRNA表达的影响

目的探讨推拿延缓失神经骨骼肌萎缩的相关机制。方法 77只Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为假手术组(n=7)、模型组(n=35)和推拿组(n=35)。后两组通过暴露并切断胫神经的方法制备失神经骨骼肌萎缩大鼠模型。造模后第2天,推拿组术侧下肢进行推拿干预。分别在造模后0 d、7 d、14 d、21 d和28 d取材,测定术侧腓肠肌湿重比,HE染色测定腓肠肌肌纤维截面积和直径,逆转录实时定量聚合酶链反应检测术侧腓肠肌组织中自噬相关因子Beclin-1、液泡分选蛋白34 (Vps34)和微管相关蛋白轻链3 (LC3)的mRNA表达。结果三组0 d时,腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径,以及Beclin-1、Vps34和LC3的mRNA表达均无显著性差异(F <1.321, P> 0.05)。与假手术组比较,模型组和推拿组腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径在不同时间下降(P <0.05),推拿组肌湿重比(除21 d)均高于模型组(P <0.05),推拿组肌纤维截面积和直径(除21 d)均大于模型组(P <0.05)。与假手术组相比,模型组和推拿组术侧腓肠肌Beclin-1、 Vps34、 LC3mRNA表达在不同时间升高(P <0.05),推拿组各项mRNA表达(除14 d)均高于模型组(P <0.05)。组内比较,模型组和推拿组腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径随时间呈进行性下降趋势(P <0.05);模型组Beclin-1、Vps34 mRNA表达在21 d后呈上升趋势(P <0.05),LC3 mRNA表达在21 d升高(P <0.05);推拿组Beclin-1 mRNA表达呈先上升后下降的趋势(P <0.05),Vps34和LC3 mRNA表达(除14 d)呈先上升后下降趋势(P <0.05)。结论推拿可能通过上调自噬相关因子Beclin-1、Vps34和LC3的mRNA表达,促进细胞自噬的激活,清除损伤细胞器和蛋白质,为肌纤维再生提供一定的合成底物和能量,从而减轻失神经骨骼肌萎缩的程度。

磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-2在代谢综合征及糖尿病肾病中的研究进展

磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-2(phosphofurin acidic cluster sorting protein-2,PACS-2)是一种具有膜转运及维持线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane,MAM)结构与功能的多功能蛋白。近年研究发现PACS-2不仅参与调节细胞凋亡等细胞生理与病理活动,同时参与MAM结构调节及胰岛素功能调节,与代谢综合征及糖尿病肾病等多种疾病发病机制相关,并有望成为相关疾病的药物新治疗靶点。本文就国内外有关PACS-2分子特征、表达定位、生物学功能及其在代谢综合征与糖尿病肾病研究中的最新进展进行阐述。

液泡分选蛋白4B在小鼠牙胚发育的时空表达

目的:研究液泡分选蛋白4B(vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)在小鼠磨牙发育不同时期的表达。方法:取胚胎13.5、14.5、16.5 d的胎鼠头部及出生后2.5、7 d的幼鼠下颌骨组织,石蜡包埋后获取第一磨牙牙胚组织切片,通过组织化学染色确定各组牙胚的发育时期,免疫组织化学法检测牙胚中VPS4B的表达分布。结果:胚胎13.5、14.5、16.5 d小鼠第一磨牙牙胚分别处于蕾状期、帽状期、钟状早期,出生后2.5、7 d分别处于分泌期和矿化期;VPS4B表达于小鼠磨牙发育的整个过程,并在构成牙胚的多种细胞中有不同程度的表达。随发育的进行,成釉细胞和成牙本质细胞中VPS4B呈强阳性持续表达,而牙囊细胞表达逐渐减弱。结论:VPS4B表达于正常小鼠牙胚发育过程中且随发育进行表达发生改变,VPS4B可能参与牙胚的正常发育。

细胞分选蛋白17多克隆抗体的制备和鉴定及在小鼠体内的表达

目的制备细胞分选蛋白家族成员细胞分选蛋白17(SNX17)的多克隆抗体,为深入研究SNX17奠定基础。方法 PCR扩增编码人SNX17C端270个氨基酸的cDNA片段,DNA重组入原核表达载体pGEX-4T-1和pMal-C2x,转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分别表达GST-SNX17C端和MBP-SNX17C端融合蛋白。采用电泳纯化的GST-SNX17C端融合蛋白于第1天,第28天,第42天3次免疫新西兰白兔。采用亲和层析和分子筛纯化的MBP-SNX17C端融合蛋白,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中多克隆抗体的效价,于第56天取兔全血,析出血清,纯化IgG。免疫印迹法检测SNX17兔多克隆抗体的有效性和特异性,免疫印迹法检测小鼠30种器官中SNX17的表达。结果成功构建了pGEX-4T-1/SNX17C端和pMal-C2x/SNX17C端的表达质粒,成功诱导表达纯化了GST-SNX17C端和MBP-SNX17C端融合蛋白,纯化后的IgG可识别COS-7细胞中外源转入的GFP-SNX17,并与GFP抗体识别的条带在同一位置上,通过SNX17C端多克隆抗体检测了SNX17在小鼠子宫、卵巢和乳腺中表达高而在睾丸、前列腺和输精管中表达低。结论成功制备特异而有效的兔抗人SNX17C端多克隆抗体,此抗体可用于免疫印迹法分析,初步确定了SNX17在小鼠器官中的表达谱。

磷酸弗林酸性簇分选蛋白2对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大的影响及其机制

目的探究磷酸弗林酸性簇分选蛋白2(PACS-2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥大的影响及其机制。方法剪取并消化出生1~2 d的SD大鼠乳鼠的心脏组织,采用差速贴壁法获取乳鼠心肌细胞(NRCMs),原代培养24 h。以浓度为1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,采用Western blot方法检测细胞中FUN14域蛋白1(FUNDC1)、PACS-2、三磷酸肌醇受体蛋白(IP3R)的表达水平,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测细胞中心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA的表达水平。将NRCMs分为A~C组,A组使用无血清培养基培养,B、C组分别转染si-NC和si-PACS-2,采用Western blot方法检测各组细胞中PACS-2蛋白的表达水平。将NRCMs分为D~G组,D组使用无血清培养基培养,E组以浓度0.15μmol/L的AngⅡ培养,F、G组分别转染si-NC、si-PACS-2后再以浓度0.15μmol/L的AngⅡ培养,采用TRITC-鬼笔环肽染色技术检测各组心肌细胞表面积,RT-qPCR检测各组细胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平,以Fluo-4,AM探针检测各组细胞胞质Ca^(2+)的水平。将NRCMs分为H~K组,H组使用无血清培养基培养,I、J组分别转染si-NC、si-PACS-2,K组转染si-PACS-2并且以浓度1μmol/L的钙调蛋白(CaM)拮抗剂处理后,采用RT-qPCR方法检测各组细胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平。结果以浓度1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平呈时间依赖性上调(F=25.73~58.30,P<0.05),并且处理第24小时时相较于第0小时时均显著上调(t=5.35~37.50,P<0.05)。以浓度1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,NRCMs中IP3R、PACS-2以及FUNDC1蛋白的表达水平均呈时间依赖性下调(F=5.37~9.07,P<0.05),并且处理第24小时时相较于第0小时时显著下调(t=6.55~7.42,P<0.05)。与B组相比,C组NRCMs中PACS-2蛋白的表达水平显著下调(t=5.92,P<0.05)。与F组相比,G组NRCMs中心肌细胞表面积增大,ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平及胞质Ca^(2+)水平均上调(t=3.50~26.60,P<0.05)。与J组相比,K组NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA表达水平均显著下调(t=3.27~5.13,P<0.05)。结论敲低PACS-2可增加NRCMs中胞质Ca^(^(2+))水平,并且可能以Ca^(^(2+))-CaM依赖的方式加重AngⅡ诱导的心肌肥大的发生。

分选链接蛋白1抑制结直肠癌细胞增殖和迁移的作用和机制研究

目的·分析分选链接蛋白1(sorting nexin 1,SNX1)在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中的表达,探索其对CRC细胞增殖及迁移的影响及潜在的分子机制。方法·基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)、基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression,GTEx)以及基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中CRC相关的转录组数据和临床病理信息,利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)软件进行富集分析。采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫组织化学染色(immunohistochemistry staining,IHC)检测SNX1在CRC组织和细胞中的表达。使用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低SNX1的表达,观察SNX1对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响。通过相关性分析探索SNX1影响CRC细胞迁移的潜在分子机制,在SNX1敲低细胞株中进行mRNA水平的初步验证。结果·根据对TCGA中CRC患者以及组织芯片样本数据的分析,发现SNX1在CRC组织中表达下调,且与肿瘤的直径以及是否发生远处转移具有相关性。敲低SNX1能够促进肿瘤细胞的增殖和迁移。在CRC中,SNX1的表达与结肠癌转移相关因子1(metastasis associated in colon cancer 1,MACC1)、间质-上皮转换因子(mesenchymal to epithelial transition factor,MET)以及Notch负相关,敲低SNX1后上述基因表达上调;敲低SNX1后,上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)标志物钙黏蛋白1(cadherin 1,CDH1)表达下调,波形蛋白(vimentin,VIM)、Snail家族转录因子1(Snail family transcriptional repressor 1,SNAI1)表达上调。结论·SNX1在CRC组织中表达显著降低,且与患者预后正相关;SNX1低表达能够促进CRC细胞的增殖和迁移,与MACC1-MET通路、EMT相关;SNX1可作为CRC不良预后的潜在生物标志物和新的治疗靶点。

ShRNA干扰G蛋白偶联受体相关分选蛋白1对肺癌细胞增殖凋亡和裸鼠成瘤影响

目的探讨shRNA干扰G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)对肺癌细胞增殖凋亡和裸鼠成瘤影响。方法将GASP-1-shRNA1、2和3用Lipofectamine 2000转染到肺癌A549细胞。选择转染GASP-1-shRNA1的细胞,建立空白对照组、空载体转染组和GASP-1-shRNA1转染组,采用菌落形成试验和流式细胞术分别检测肺癌A549细胞增殖和调亡;采用Western Blot检测ki67、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达量。将转染GASP-1-shRNA1细胞注射裸鼠后腿建立原位异种移植小鼠模型。检测肿瘤的生长,并通过免疫组化检测ki67和caspase-3蛋白表达量。结果GASP-1-shRNA1、2和3转染A549细胞后GASP-1 mRNA和蛋白表达量均显著下调,尤其转染GASP-1-shRNA1组。GASP-1下调能抑制A549细胞增殖,并促进A549细胞凋亡;在体内试验中,下调GASP-1能抑制体内肿瘤生长,同时也能抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡。结论GASP-1的下调可抑制肺癌细胞增殖、促进凋亡,并抑制肿瘤生长。

G蛋白偶联受体相关分选蛋白1在非小细胞肺癌中表达的临床意义及其与顺铂化疗抵抗的关系

目的探究G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GPRASP1)的表达与非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的顺铂(DDP)敏感性的关系。方法收集癌旁组织、原发NSCLC组织及复发NSCLC组织,用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测GPRASP1和腺苷三磷酸结合盒式亚家族A成员5(ABCA5)mRNA的表达情况。空白组和过表达组分别用慢病毒转染空白载体和GPRASP1过表达载体于A549细胞中;对照组和抵抗组分别用慢病毒转染对照小干扰RNA(si-control)于A549细胞及DDP耐药细胞中;干扰组用慢病毒转染GPRASP1小干扰RNA(si-GPRASP1)于DDP耐药细胞中。用CCK-8实验法检测细胞对DDP的半抑制浓度(IC50),用RT-PCR法检测各组细胞中GPRASP1与ABCA5的表达情况。结果癌旁组织、NSCLC组织与复发NSCLC组织中GPRASP1 mRNA表达量分别为(1.27±0.16)×10^(-2)、(2.68±0.30)×10^(-2)和(3.89±0.72)×10^(-2),ABCA5 mRNA表达量分别为(1.03±0.13)×10^(-1)、(1.85±0.21)×10^(-1)和(2.67±0.61)×10^(-1);复发NSCLC组织中GPRASP1和ABCA5 mRNA表达量均显著高于癌旁组织及NSCLC组织,差异均有统计学意义(均P<0.01)。空白组和过表达组的GPRASP1 mRNA表达量分别为1.00±0.16和5.98±0.66,ABCA5 mRNA表达量分别为1.00±0.09和2.81±0.33,DDP IC50分别为(2.10±0.13)和(3.50±0.11)μmol·L^(-1),差异均有统计学意义(均P<0.01)。对照组、抵抗组和干扰组的GPRASP1 mRNA表达量分别为1.00±0.11、3.37±0.31和0.81±0.13,ABCA5 mRNA表达量分别为1.00±0.10、4.06±0.43和2.30±0.25,DDP IC50分别为(2.08±0.13)、(7.87±0.61)和(5.77±0.55)μmol·L^(-1);抵抗组的上述指标与对照组和干扰组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论GPRASP1可显著促进ABCA5的表达,并介导NSCLC DDP抵抗。

液泡分选蛋白4B对骨关节炎软骨细胞凋亡的调控作用

目的:探讨液泡分选蛋白4B(VPS4B)对骨关节炎软骨细胞凋亡的调控作用。方法:通过内侧半月板部分切除加前交叉韧带切断的方法建立骨关节炎SD大鼠模型,通过RT-PCR和免疫组化检测VPS4B在大鼠关节软骨中的表达。番红O/固绿染色方法检测大鼠膝关节软骨组织形态变化。通过用10 ng/mL的IL-1β诱导人软骨肉瘤细胞SW1353 24 h来模拟骨关节炎样软骨细胞损伤,Western blot检测SW1353细胞中VPS4B、凋亡相关因子(cleaved caspase-3和cleaved PARP)和磷酸化p38的表达。转染si-RNA敲低SW1353细胞中VPS4B表达,并评估其对IL-1β诱导的SW1353细胞凋亡标记和p38 MAPK信号通路的影响。膜联蛋白V (Annexin V)和碘化丙啶(PI)染色用于检测软骨细胞凋亡。结果:VPS4B在模型组大鼠的关节软骨中明显上调(P<0.05)。IL-1β诱导24 h后,SW1353细胞中的VPS4B、cleaved caspase-3、cleaved PARP和p-p38蛋白表达水平均明显增加。而转染VPS4B-si RNA敲低VPS4B的表达后,cleaved caspase-3、cleaved PARP和p-p38蛋白表达水平均被抑制,并且抑制了IL-1β诱导细胞的凋亡率。结论:VPS4B在骨关节炎发病过程中明显上调,VPS4B的上调通过激活p38 MAPK信号通路来促进软骨细胞凋亡。

G蛋白偶联受体相关分选蛋白1对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学功能的影响

目的 探讨G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学功能的影响。方法 将乳腺癌MDA-MB-231细胞分别三组,分别为空白对照组(转染shNC)、shRNA组(转染shRNA)和shGASP组(转染shGASP-1)。qRT-PCR检测GASP-1 mRNA水平,Western blot检测GASP-1蛋白水平,CCK-8检测MDA-MB-231细胞增殖;克隆形成实验检测MDA-MB-231细胞克隆形成能力,Transwell法检测MDA-MB-231细胞迁移能力,流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞凋亡。结果 三阴性乳腺癌组织中GASP-1mRNA的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。与空白对照组和shRNA组相比,shGASP组中的GASP-1 mRNA和蛋白显著降低(P<0.05);48~72 h,shGASP组中MDA-MB-231细胞增殖能力显著低于空白对照组(P<0.05);与空白对照组和shRNA组相比,shGASP组中的MDA-MB-231细胞克隆形成能力明显降低(P<0.05);shGASP组中的MDA-MB-231细胞侵袭明显降低(P<0.05);shGASP组中MDA-MB-231细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。结论 沉默GASP-1可以抑制MDA-MB-231细胞增殖、侵袭,促进其凋亡,提示GASP-1可能与三阴性乳腺癌的发生发展密切相关,有望成为三阴性乳腺癌治疗的新靶点。

活性维生素D对高糖诱导的足细胞自噬相关蛋白Beclin-1和空泡分选蛋白34的调控作用研究

目的探讨活性维生素D(VitD)对高糖诱导的足细胞自噬相关蛋白Beclin⁃1和空泡分选蛋白34(Vps34)的调控作用。方法(1)体外培养永生化小鼠足细胞,用高糖30 mmol/L培养0、3、6、12、24、36、48 h后,采用Western blot检测微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3⁃Ⅱ)、Beclin⁃1和Vps34的蛋白表达,激光共聚焦观察足细胞骨架蛋白Synatopodin、微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达变化;(2)1α,25二羟维生素D3[1α,25(OH)2D3](1、10、100 nmol/L)和高糖(HG,30 mmol/L)培养足细胞48 h,激光共聚焦观察Synatopodin、LC3⁃Ⅱ的表达变化,透射电镜下观察足细胞内自噬体的形成,Western blot及RT⁃qPCR半定量检测LC3⁃Ⅱ、Beclin⁃1和Vps34的蛋白和mRNA表达;(3)加入自噬抑制剂3⁃甲基腺嘌呤(3⁃MA,10 mmol/L)作用48 h后,Western blot检测LC3⁃Ⅱ、Beclin⁃1和Vps34的蛋白表达。结果足细胞经高糖处理后LC3⁃Ⅱ表达增强,Beclin⁃1和Vps34的蛋白和mRNA水平也逐渐升高,24 h达高峰,随后表达逐渐降低(P<0.05)。与高糖组相比,高糖+1α,25(OH)2D3(HG+VitD)组Beclin⁃1、Vps34蛋白和mRNA的表达呈浓度依赖性上调,抑制高糖长时刺激导致的自噬活性下降(P<0.05);与HG+VitD组相比,HG+VitD+3⁃MA组足细胞Beclin⁃1、Vps34蛋白和mRNA的表达明显降低(P<0.05)。结论足细胞在高糖刺激下早期自噬活性增强,长期刺激自噬抑制;1α,25(OH)2D3可能是一种自噬活化剂,通过调控自噬相关蛋白Beclin⁃1、Vps34水平,促进自噬溶酶体形成,改善高糖诱导的足细胞损伤。

分选蛋白家族与细胞内含体运输调控网络

分选蛋白家族是生物进化过程中相对保守的一类蛋白,其结构上含吞噬细胞氧化酶同源性结构域（PX domain）结构域,与膜结构中的磷酸肌醇发生紧密结合,在内含体介导的分选运输、再循环利用和信号转导中起着重要作用。本研究主要从细胞内逆向运输网络分选途径梳理分选蛋白家族的调控作用,及其与逆运复合体retromer共同参与的内含体分选途径;并对现有的分选蛋白家族成员依据所含结构域的不同进行分类;同时,探求分选蛋白家族与相关疾病的内在联系,及其在疾病防治中作为潜在治疗靶点的可能性。

微小RNA-6791-5p靶向磷酸呋喃酸性簇分选蛋白2抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭

目的探讨微小RNA(miR)-6791-5p对人结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响及其分子机制。方法采集培养人结直肠癌细胞系RKO、SW480、DLD1、HCT116以及人正常结肠上皮细胞NCM460。通过反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-6791-5p在各细胞系中的表达水平(表达倍数为0.52±0.04、0.83±0.06、0.60±0.12、0.68±0.07),并构建miR-6791-5p模拟物(miR-6791-5p mimic)及其阴性对照Negative control,并将其转染至RKO细胞。使用RT-qPCR检测miR-6791-5p和PACS2 mRNA的表达水平(表达倍数为0.468±0.032)。利用蛋白质印迹法(Western blot)检测PACS2蛋白的表达水平[RKO:(51.590±6.018)%]。使用两样本t检验进行统计分析,结果以均数±标准差(±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果miR-6791-5p在人结直肠癌细胞系表达水平显著低于人结肠上皮细胞,其中RKO和DLD1下调最明显(RKO组低于460组:0.52±0.04比1.00、DLD1组低于460组0.60±0.12比1.00),差异有统计学意义(RKO:t=17.811,P<0.0001;DLD1:t=5.372,P<0.01)。RKO转染后,mimic组miR-6791-5p表达水平高于mimic NC组(3.28±0.44比1.00),差异有统计学意义(RKO:t=8.764,P<0.01)。细胞计数试剂(CCK-8)检测表明mimic组24、48、72、96 h细胞吸光度值显著低于mimic NC组(24 h吸光度值为0.185±0.004比0.250±0.030,48 h吸光度值为0.275±0.040比0.376±0.020,72 h吸光度值为0.497±0.120比0.657±0.010,96 h吸光度值为0.691±0.004比0.905±0.019),差异有统计学意义(RKO:t=10.821,P<0.01)。平板克隆实验表明mimic组集落形成数低于mimic NC组(115.70±12.51比176.00±19.18),差异有统计学意义(RKO:t=4.581,P<0.05)。划痕愈合实验显示miR-6791-5p mimic组划痕愈合率低于NC组[(14.960±0.848)%比(36.480±1.340)%],差异有统计学意义(t=23.491,P<0.0001)。Transwell迁徙和侵袭实验显示穿透微孔膜的细胞数mimic组低于mimic NC组(迁移数目miR-6791-5p mimic组比NC组42.330±3.512比125.700±7.760,侵袭数目分别为54.33±4.16比159.30±7.76),差异有统计学意义(Transwell迁移t=16.931,P<0.01)、(Transwell侵袭t=20.641,P<0.01)。在线靶预测软件(miRWalk、mirtarbase、targetscan)预测miR-6791-5p可能的靶基因,并通过qRT-PCR及Western blot验证,mimic组PACS2的mRNA及蛋白表达水平低于mimic NC组[比例为(51.590±6.018)%比1.00],差异有统计学意义[mRNA(RKO:t=27.951,P<0.0001);Western blot(RKO:t=13.931,P<0.001)]。结论miR-6791-5p在结直肠癌细胞中低表达,过表达miR-6791-5p能抑制结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,并且明显下调PACS2的mRNA和蛋白表达水平,说明miR-6791-5p可能通过PACS2调控结直肠癌增殖、迁移及侵袭能力。

分选连接蛋白及其相关细胞信号通路

分选连接蛋白(sorting nexins,SNXs)是一类包含PX(phox homology)结构域的高度保守真核生物蛋白,其功能主要是参与负载蛋白的内吞、分选和降解过程,以维持细胞信号的稳态和平衡。SNXs参与调控与肿瘤等疾病相关的重要信号通路,如SNX3介导分泌型糖蛋白Wnt受体Wntless的胞内循环;SNX1、SNX5等众多SNXs介导表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和转化因子β受体(TGF-β)等的内吞、分选和降解等过程。其中,对EGFR降解的调控研究最多,尤其是在肿瘤方面的进展令人鼓舞,可也较为复杂,仍有许多未解之谜。随着SNXs的深入研究,将对疾病的发生机制产生新的认识。

分选链接蛋白1在胰腺导管腺癌中的表达及其促进胰腺导管腺癌进展的机制研究

目的·探究分选链接蛋白1 (sorting nexin 1,SNX1)在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)发生和发展过程中表达水平的变化,及其对PDAC细胞增殖、迁移、凋亡和巨胞饮的影响,并分析其促进PDAC进展的分子机制。方法·分别在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression,GTEx)数据库、基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中的GSE15471数据集分析SNX1mRNA在PDAC及正常胰腺组织中的表达量变化。采用免疫组织化学染色(immunohistochemistry staining,IHC)检测PDAC患者的癌组织及癌旁组织中SNX1的表达变化。利用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测SNX1在hTERT-HPNE细胞及PDAC细胞中的表达水平。分别采用CCK8实验、平板克隆形成实验、划痕实验和流式细胞术检测由转染siRNA引起SNX1下调导致的AsPC-1、Capan-1细胞的增殖能力、迁移能力、凋亡水平的变化。构建稳定敲除SNX1的Capan-1细胞株,使用裸鼠皮下成瘤实验检测下调SNX1对细胞在裸鼠体内增殖能力的影响。利用免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)确定SNX1在PDAC细胞中的分布,并用四甲基罗丹明-葡聚糖(TMRdextran)检测由转染siRNA引起SNX1下调导致的AsPC-1、Capan-1细胞巨胞饮水平的变化。利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)软件预测与SNX1相关的信号通路,并选取转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)通路进行后续分析及实验验证。构建稳定过表达SNX1的Capan-1、AsPC-1细胞株,使用TGF-β通路抑制剂氧化苦参碱(oxymatrine,Oxy)处理上述过表达细胞,并采用CCK8实验、平板克隆形成实验、划痕实验、流式细胞术和TMRdextran检测Oxy处理对过表达SNX1引起的细胞的增殖、迁移、凋亡、巨胞饮水平变化的影响。结果·TCGA和GTEx数据库的合并分析的结果显示SNX1 mRNA在PDAC组织中的表达高于正常胰腺组织,GSE15471数据集分析的结果显示SNX1mRNA在PDAC组织中的表达高于癌旁组织(均P=0.000)。IHC的结果显示SNX1在PDAC患者的癌组织中的表达亦高于癌旁组织。qPCR和Western blotting的结果显示,与hTERT-HPNE细胞相比,SNX1在PDAC细胞中的mRNA、蛋白水平均有上调(均P<0.05)。下调SNX1能够抑制AsPC-1、Capan-1细胞的增殖、迁移能力,下调其巨胞饮水平,促进其凋亡;过表达SNX1则可产生相反的结果。同时,敲除SNX1能够抑制Capan-1细胞在裸鼠体内的增殖能力。IF的结果显示SNX1在PDAC细胞中与溶酶体存在共定位。GSEA的结果显示,SNX1的表达与细胞凋亡、三羧酸循环、TGF-β和磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路相关;在PDAC细胞中下调SNX1能够抑制TGF-β信号通路的激活,过表达SNX1则可促进该通路的激活,且加入该通路抑制剂可抑制由过表达SNX1引起的细胞表型变化。结论·SNX1在PDAC细胞和组织中高表达,其可通过激活TGF-β信号通路增强PDAC细胞的增殖、迁移能力和巨胞饮水平,并抑制其凋亡。

分选连接蛋白16的结构和功能及其在疾病中的研究进展

分选连接蛋白(SNX)16是SNX家族成员之一,其结构含有易与磷脂酰肌醇-3-磷酸结合的一类含有吞噬细胞氧化酶同源性结构域及C末端的卷曲螺旋结构域。研究表明,SNX16在细胞内吞、蛋白分选和细胞信号转导等过程中发挥了重要作用,并且与多种疾病的发生密切相关。本文就SNX16的结构特点、生物学功能及其在疾病中的作用进行综述,以期为SNX16在疾病防治中的研究提供参考。

植物种子贮藏蛋白质及其细胞内转运与加工

高等植物种子成熟过程中贮存大量的贮藏蛋白质作为种子发芽和初期生长的重要营养来源。根据溶解性不同,种子贮藏蛋白质可分为白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4类。在种子胚发育过程中,醇溶蛋白在粗面内质网合成后形成蛋白质聚集体,直接出芽形成蛋白体并贮存其中。白蛋白、球蛋白和谷蛋白在粗面内质网以分子量较大的前体形式合成后,根据各自的分选信号进入特定的运输囊泡,经由受体依赖型运输/聚集体形式运输转运至蛋白质贮藏型液泡中,然后经过液泡加工酶等的剪切转换为成熟型贮藏蛋白质并贮存其中。蛋白质的合成、分选、转运和加工等过程影响种子蛋白质的品质及含量。该文对种子贮藏蛋白质的分类和运输、加工以及这些过程对种子蛋白质品质和含量的影响进行了概述。